Een muizenmodel van Muscle Training door Neuromusculaire elektrische stimulatie

1. Elektrode Voorbereiding Snij een 1 cm x 1 cm doorsnede van de vector printplaat. Stabiliseren 2 wirewrap pinnen met behulp van een vice grip, met pennen onderlinge afstand van ongeveer 3,5 mm van elkaar. De vorkvormig uiteinden van de pennen worden naar boven. Buig wirewrap pinnen in een hoek van 90 °, ongeveer halverwege de lengte, met behulp van tang. Ver koperdraad connectoren ongeveer 7 cm uit lood verbinding door strippen van de draadisolatie. Soldeer een van de koperdraden de vorkvormig einde van een de wirewrap pennen. Herhaal solderen stap voor de andere wirewrap pin. Trek krimpen slang op soldeerverbinding tussen de koperen draden en goud pinnen om te isoleren en te stabiliseren. Verwarm de buis met behulp van de soldeerpunt. Plaats de niet-gesoldeerde uiteinden van de wirewrap pinnen in de aangrenzende openingen van het breadboard printplaat. Zorg ervoor dat de wirewrap pinnen zijn parallel aan elkaar en stick door middel van het bord zodanig dat de tips op dezelfde afstand bevindt als die via het bord. Embedden gesoldeerde uiteinden van de pennen in heldere epoxy. Laat de epoxy uit te harden voor ongeveer 10 minuten, of totdat het volledig droog is. Herhaal de toepassing van epoxy tot aan de pennen en vector printplaat zijn volledig ingebed in om de structurele integriteit en trekontlasting voor de draden te bieden. Schuur de epoxy behulp van een metalen bestand naar de uiteinden van de gouden spelden bloot te leggen. Gebruik een multimeter om ervoor te zorgen de twee kabels zijn niet elektrisch kortgesloten en dat de draden over de juiste continuïteit Bevestig de elektrode gaat van de NMES apparaat aan vrouwelijke 2-weg aansluitkabel (Pomona patchkabel). 2. Toebereiding van dieren Dieren zijn verdoofd via inhalatie met behulp van 2% isofluorane (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) in 100% O 2 gas. Het dier moet onder narcose blijven gedurende thij NMES sessie. Alvorens de NMES protocol uitvoeren van een toe pinch opdat het dier volledig verdoofd. Animal moeten regelmatig worden gecontroleerd om te reageren op stimulatie met het oog op de verdoving niveau voldoende is. De verdoving moet worden aangepast als dat nodig is. Beweging andere dan die van de gestimuleerde been, veranderingen in de luchtwegen diepte, en de kleur van de slijmvliezen moeten allemaal regelmatig worden geëvalueerd om de diepte van de anesthesie te bewaken. Plaats het dier in laterale decubitus. Breng oogheelkundige smeermiddel voor de ogen, om het hoornvlies droging te voorkomen tijdens de procedure. Scheer het achterbeen te behandelen gebied, en veeg met alcohol. Veeg de elektrode met 3% bleekmiddel, daarna spoelen met water. Breng een laag van geleidende gel over de plaats waar de elektrode zal worden toegepast. Opnieuw zo nodig gedurende de NMES protocol stroom tussen de elektrode en de huid. Een warmtelamp or circulerende water deken moet worden gebruikt om de normale kerntemperatuur van het lichaam varieert stand te houden. Opmerking: Alle procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Universiteit van Pittsburgh Institutional Animal Care en het gebruik Comite en uitgevoerd in zeker van PHS en AAALAC Int. geaccrediteerde programma en faciliteiten. 3. Stimulatie Plaatsing van de elektroden: Voor de stimulatie van de anterieure compartiment spieren, met inbegrip van de tibialis anterior en de m. extensor digitorum longus, plaatst u de oppervlakte elektrode direct over diepe van het dier fibulaire zenuw, dat is een distale tak af van de gemeenschappelijke peroneus, en ligt net anterieur van het de fibulaire hoofd. Voor de stimulatie van de anterieure compartiment spieren, is plaatsing van de elektrode bevestigd wanneer stimulatie lokt volle enkel dorsaalflexie en volledige uitbreiding van de cijfers. Anderzijds, dorsaalflexie, in afwezigheid van cijferig blijkt dat slechts de tibialis anterior spier wordt gestimuleerd. Deze samentrekkende reactie gericht kan gewenst zijn, afhankelijk onderzoeksopzet. Het samentrekken van de spieren is verdeeld in 2 fasen van de stimulatie: een vrij bewegende, concentrische fase, die optreedt tijdens de eerste ~ 0,5 seconden. Tijdens deze eerste fase, de poot beweegt vanuit een ruststand naar maximale dorsaalflexie en cijferig nummer. De tweede fase van stimulatie is een isometrische contractie opgelopen aan het einde bereik dorsaalflexie en cijferig nummer. Stimulatie parameters: Dit model maakt gebruik van NMES de 300 PV Empi multifunctionele elektrotherapie apparaat, dat 2 kanalen van conventionele NMES (zie tabel) biedt. Voor de toepassing van dit model wordt slechts een kanaal gebruikt. Gebruikte parameters omvatten symmetrische golfvorm, een pulsduur van 150 ps en een frequentie van 50 Hz. Stimulatie tijd is ingesteld op 5 seconden, met een 0,5 tweede helling en een 0,5 tweede helling naar beneden. Hierdoor kan de spier om meer geleidelijk acclimate aan de stimulatie. In het huidige protocol, werd uit de tijd tussen de weeën ingesteld op 10 seconden, maar dit kan worden aangepast afhankelijk van het gewenste effect. Verminderde off tijden zal resulteren in een snellere start van spiervermoeidheid. Deze parameters stimulatie werden op basis van klinische protocol ter spierkracht met neuromusculaire elektrische stimulatie te verbeteren, zonder optreden aanzienlijke skeletspier beschadiging 1, 15, 16. Muizen nog twee sets van 10 contracties, met 5 minuten rust tussen de sets. Voor volwassen dieren, is NMES intensiteit meestal gestart met 9 mA. Vanuit onze ervaring, dit is bij benadering de maximale beginnen intensiteit die niet meteen een merkbare gang bijzondere waardevermindering te induceren na stimulatie. Voor de daaropvolgende NMES sessies wordt de intensiteit verhoogd 1 mA telkens de dieren kunnen 20 vol dorsiflexions voltooien. Na afronding van de stimulatie protocol en recozeer van anesthesie, dieren meestal blijk van een normale looppatroon en houding. Gangwerk moet onverkort van kracht blijven gedurende de duur van het NMES programma. 4. Representatieve resultaten De NMES protocol beschreven in dit artikel is geïmplementeerd in verschillende muizenstammen, waaronder: Wild Type (B6/10), B6.SCID en mdx / SCID muizen. Vertegenwoordiger resultaten van NMES uitgevoerd over 4 weken (20 sessies) 3-5 maanden oud mdx / SCID worden gepresenteerd. Dieren werden humaan gedood door cervicale dislocatie terwijl ze onder verdoving. De tibialis anterior geoogst en direct ingevroren in 2 methyl-butaan vooraf afgekoeld in vloeibare stikstof en bij -80 ° C. Serial doorsneden (10 urn) werden verkregen en gemonteerd glijbanen. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van standaard statistische software pakketten (SPSS, v19.0 software). Eerst werd Levene's test gebruikt om te beoordelen of er was gelijkheid van varianties. Onafhankelijke steekproeven t-test uitgevoerd om de verschillen tussen NMES en de controlegroep te onderzoeken. Hematoxyline en eosine (H & E) vlekken werden uitgevoerd om te onderzoeken of de NMES protocol zou leiden tot een grotere schade in de dystrofische spier. Een deel werd geselecteerd, en de foto's werden verkregen met behulp van een lichtmicroscoop (Nikon Eclipse E800, Nikon, Japan). Het totaal aantal vezels en het aantal vezels met centraal gelegen kernen werden handmatig geteld met behulp van de National Institutes of Health (NIH) – ontwikkelde software voor beeldanalyse, Image J. Er was geen significante toename van de regeneratie-index (aantal centraal kernhoudende vezels / totaal aantal vezels) in de dieren op NMES, in vergelijking met controles (p = 0.802, figuur 1). Dit suggereert dat de toepassing van NMES niet meer de degeneratie-regeneratie cascade waargenomen Dystrofe dieren en is derhalve niet waarschijnlijkte induceren een verhoogde spierblessure. Immunofluorescentie kleuring voor CD31 werd uitgevoerd om het effect van de 4-week NMES protocol te onderzoeken op spier vasculariteit. In het kort werden spier gefixeerd in 4% formaline en geblokkeerd met 5% paardeserum (HS). Secties werden geïncubeerd met een anti-muis rat primaire antilichaam (1:300 verdunning in 5% HS) en behandeld met een 555-gelabelde geit anti-rat secundair antilichaam (1:300 verdunning in 5% HS). Om het totale aantal CD31 positieve cellen kwantificeren werd een deel geselecteerd en gefotografeerd met fluorescentiemicroscopie (Nikon Eclipse E800, Japan). Het totale aantal capillairen werd met de hand geteld met behulp van Noord-Eclipse Software (Empix Imaging Inc.) Er was een significante toename van het aantal CD31 positieve cellen in de dieren op NMES in vergelijking met controles (p <0,01, figuur 2) dat aangeeft dat de NMES protocol als beschreven bevordert skeletspieren angiogenèse. <strong> In situ contractiele testen: Vier weken na voltooiing van een NMES protocol, werd contractiele testen van de voorste compartiment spieren uitgevoerd met behulp van een in situ testapparatuur (Model 809B, Aurora Scientific Inc, Canada), stimulator (Model 701C, Aurora Scientific Inc , Canada), en de krachtopnemer (Aurora Scientific Inc, Canada). In het kort werd de peroneus van verdoofde dieren geïsoleerd via een kleine incisie lateraal van de knie. Muizen werden vervolgens rugligging op een platform geplaatst en de voet wordt getest werd geplaatst op de voetplaat. Het achterbeen gebruikt voor het testen werd gestabiliseerd met een doek tape op de knie en voet. Spieren werden gestimuleerd met behulp van een haak elektroden ingebracht onder de huid. Muscle tetanische krimp werd getest met een frequentie van 150 Hz voor 350 ms om te onderzoeken of de 4-week NMES protocol zou verbeteringen in de spierkracht te veroorzaken. De resultaten werden genormaliseerd tot natte spier gewicht. Er was ongeveer een 30% toename van het tetanic samentrekking van dieren op NMES, in vergelijking met controles (p = 0,005) (Figuur 3), wat suggereert beschreef het protocol verbetert de spierkracht in mdx / SCID dieren. . Figuur 1 Hematoxyline & Eosine skeletspieren kleuring van dystrofische (MDX) / immunodeficiënte muizen (4-5 maanden) (10x vergroting): A) onbehandelde controles, B) na 4 weken NMES. Figuur 2. CD31 immunofluorescentie (rood), als een marker van de skeletspieren vascularisatie, in de skeletspieren van de dystrofische (MDX) / immunodeficiënte muizen (4-5 maanden) (20x vergroting) A) onbehandelde controles, B) na 4 weken NMES. Figuur 3. Contractiele testenvan de voorste compartiment spieren in de hand en dieren behandeld met NMES gedurende 4 weken. mNm = milli Newton meter. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .