Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

1. Préparation des milieux et tampons YNB: Pour un litre, de suspendre 6,9 ​​g de base azotée de levure sans acides aminés et 0,77 g de mélange supplément complet sans uracile dans 1 l d'eau. Autoclave. Conserver à 4 ° C. YNBA: Pour 400 ml, 2,76 g de base de suspendre l'azote de levure sans acides aminés, 0,38 g de mélange supplément complet sans uracile et 8g agar bactériologique dans 350 ml d'eau. Autoclave. Mélanger 8 g de glucose avec 50 ml d'eau et faites chauffer doucement jusqu'à dissolution. Stériliser à travers un filtre de 0,2 um et ajouter à la YNBA tandis la gélose est fondu. Stocker à température ambiante. Moyenne 20% de glucose: Pour 500 ml, mélanger 100 g de glucose par 500 ml YNB et faites chauffer doucement jusqu'à dissolution. Passer à travers un filtre de 0,2 uM dans un flacon stérile Duran. Stocker à température ambiante. Milieu galactose 20%: Pour 2 litres, mélanger 400 g de galactose avec YNB 2l et faites chauffer doucement jusqu'à dissolution. Passez à travers un filtre de 0,2 um dans un flacon stérile Duran. Entreposer à la colère ambianterature. Les stocks inhibiteur de protéase: CFTR est très sensible à la protéolyse 4. Les auteurs ont trouvé des inhibiteurs de la suite pour être efficace dans la limitation de la protéolyse, bien que les lecteurs voudront peut-être adapter cette liste pour répondre à leurs exigences propres. Entreposer dans 100 aliquotes à -20 ° C pour réduire les problèmes de gel-dégel. Tous les inhibiteurs doit être dilué à partir des solutions mères à la concentration de travail comme ci-dessous: Inhibiteur Concentration d'images Préparation de la pâte Concentration de travail AEBSF 200 mM Dissoudre 48 mg dans 1 ml d'eau distillée 0,2 mM Benzamidine 300 mM Dissoudre 36 mg dans 1 ml d'eau distillée 0,3 mM Chymostatine 4 mM Dissoudre 2,5 mg dans 1 ml sèche MSSO 4 uM E-64 7 mM Dissoudre 2,5 mg dans l'eau distillée 1ml 7 uM Leupeptine 20 mM Dissolvez 10 mg dans 1 ml d'eau distillée 20 uM Pepstatine A 15 mM Dissolvez 10 mg dans 1 ml de DMSO sec 15 uM PMSF M 1 Dissoudre 174mg dans 1 ml de DMSO sec 1 mM TNT (1 M): dissoudre 154 mg de dithiothréitol dans l'eau distillée 1ml. Conserver à -20 ° C. Utilisez moins 1:1000 dilution dans des tampons indiquées. EDTA (0,5 M): Mix 29,22 g d'acide éthylènediaminetétraacétique avec 100 ml d'eau. Ajouter goutte à goutte NaOH 10 N jusqu'à ce que tout de l'EDTA a dissous et le pH atteint 8. Compléter à 200 ml avec de l'eau et de passer à travers un filtre de 0,2 um dans un flacon stérile Duran. Stocker à température ambiante. CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M sorbitol, EDTA 1 mM): Dissoudre 18,17 g de Tris-base dans 350 ml d'eau et ajuster le pH à 7,4 par addition de HCl. Ajouter 51,35 g de sorbitol et de faire du volume à 500 ml avec de l'eau. Autoclave. Ajouter 1 ml de solution stock de l'EDTA et conserver à 4 ° C. CFTR tampon (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v de glycérol): Dissoudre 6,06 g de Tris-base dans 500 ml d'eau. Ajuster le pH à 8 avec HCl, ajouter 100 ml de glycérol et ajuster à 1 L avec de l'eau. Autoclave et conserver à 4 ° C. 2x colorant de charge: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), le glycérol 5%, 5 mM d'EDTA (pH 8,0), 0,02% bleu de bromophénol, 4% SDS, 0,05 M de DTT. Faire 10 ml, aliquote et conserver à -20 ° C. 2. Les transformants de dépistage Ce protocole suppose que le gène de fusion CFTR-GFP-8His a été inséré dans un plasmide de levure aval à un promoteur du galactose GAL1 (Fig.1) et que le plasmide a été transformé en FGY217 cellules, une délétion mutant de S. cerevisiae PEP4 10 </em>. Les cellules peuvent être cultivées sur des plaques YNBA et stockées pendant plusieurs semaines à 4 ° C. Pour le stockage à long terme, les stocks de glycérol devrait être faite et conservée à -80 ° C. Méthodes pour le clonage et la transformation sont décrits en détail par Drew et al. (2008) 10. Choisissez bien séparés 5-10 colonies à partir d'une plaque de transformation. Transférer chaque colonie dans un tube séparé 50 ml stérile Falcon contenant 9 ml et 1 ml de YNB moyenne 20% de glucose. Pour cette étape, il est important d'avoir une concentration finale de 2% de glucose (p / v) dans la culture pour maintenir la croissance des cellules. Cultiver la nuit pendant 16 heures à 250 rpm, 30 ° C dans un incubateur orbitale secouant. Faire des stocks de glycérol pour chacune des colonies blindés. Ajouter stérilement 0,8 ml des cultures d'une nuit à 0,2 ml de glycérol stérile dans marquées vis-top flacons, homogénéiser brièvement au vortex et stocker à -80 ° C. Diluer les cultures restantes nuit à un volume final de 50 ml dans YNB, dont 250 pl de milieu de glucose à 20%.Pour cette étape, il est important de diluer la concentration de glucose à environ 0,1% (w / w) dans la culture parce que le glucose élevé peut réprimer le promoteur GAL1 10. Cultiver des cultures dans étiquetés Erlenmeyer 250 ml dérouté flacons à une DO 600 de 0,7-0,8 à 250 rpm, 30 ° C dans un incubateur orbitale secouant. Provoquer des cultures par addition de 5 ml de milieu galactose 20% à chaque flacon et se développer pendant 16 heures. Confirmer l'expression de la protéine CFTR par microscopie à fluorescence. Prenez 100 pi de la culture et ajouter 100 ul de glycérol afin de limiter la mobilité cellulaire dans une solution. Analyser les cellules sur un microscope Delta Vision RT de restauration (ou similaire), en utilisant un laser bleu sous un filtre FITC (longueur d'onde d'excitation de 490 nm de longueur d'onde et l'émission de 528-538 nm). Expression positive de la protéine de fusion GFP-CFTR devrait être visible comme un anneau de fluorescence à la membrane plasmique des cellules de levure. Des cellules de levure non transformées peut être utilisé comme témoin. Transférer lecultures dans des tubes Falcon 50 ml. Récolter les cellules par centrifugation à 3500 xg, 4 ° C pendant 10 minutes dans une centrifugeuse de paillasse. Alors que la centrifugeuse est en cours d'exécution, de préparer 2 microtubes ml avec bouchon à vis contenant environ 500 ul de billes de verre lavée à l'acide et les placer sur la glace. Jeter les surnageants et remettre chaque culot dans 500 à 800 pi glacée CRB avec inhibiteurs de la protéase. Transfert des suspensions aux microtubes contenant les billes et de garder sur la glace. Lyse des cellules en secouant vigoureusement / vortex chaque tube de centrifugeuse pendant 10 périodes de 30 secondes, reposant sur de la glace entre les périodes. Un beadbeater peut être utilisé comme une alternative, par exemple, un mini-beadbeater BioSpec exploité pendant 3 min. Placer les tubes dans une micro-centrifugeuse de paillasse et à 3.500 xg, 4 ° C pendant 5 minutes. Transférer les surnageants contenant la population membranaire brut pour nettoyer des microtubes et les placer sur la glace. Ajouter 500 ul frais glace cold CRB les inhibiteurs de protéase à chaque tube et répétez le processus d'accumuler les membranes. Recueillir les membranes brut par centrifugation à vitesse maximale, 4 ° C dans une microcentrifugeuse de paillasse pendant 2 heures. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 50 ul de tampon de glace CFTR froid. Dans des microtubes propres, mélanger 15 pi de chaque suspension avec 15 ul de colorant de charge 2x par aspiration et refoulement. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Ne pas faire bouillir les échantillons, car cela entraînerait des protéines membranaires CFTR et l'autre pour former des agrégats insolubles SDS-et aussi dénaturer le tag GFP. Charger les échantillons le long d'PageRuler plus normes protéines précolorés (Fermentas) sur un gel de 4-20% Tris / glycine gradient (NuSep) et exécuter à 150 V pendant 40 minutes ou jusqu'à ce que le front de colorant se trouve au fond du gel. Identifier les plus hautes cellules exprimant par fluorescence dans le gel. Placer dans un système d'imagerie de fluorescence, comme un scanner Typhoon. Scannez le gel de uchanter le laser bleu à une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 526 nm. La fusion CFTR-GFP devrait être visible à environ 220 kDa. Il y aura aussi une bande faible fluorescente visible à environ 70 kDa qui est probablement une levure intrinsèque DCP contenant des protéines membranaires (comme sous-unité de la succinate déshydrogénase A) 11,12. Colorer le gel avec de Coomassie, décolorer et de numériser le gel de comparaison pour l'analyse par fluorescence en utilisant un paquet d'image de visualisation pratique logiciel. Le gel teinté au bleu de Coomassie permet une évaluation relative des niveaux d'expression de CFTR-GFP dans les différents lignées clonales après la normalisation de la quantité de protéine totale chargée sur chaque piste du gel. Streak sur la lignée cellulaire exprimant le plus élevé de son stock de glycérol (2,2) sur une nouvelle YNBA et incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours. Cette plaque peut alors être stocké pour un maximum de 2 semaines à 4 ° C. 3. Cult fermenteur à grande échelleure Préparer les pré-cultures pour le fermenteur. Racler 1cm 2 de surface de cellules de la YNBA Plaque (2,13) ​​en utilisant une boucle stérile et ajouter à 45 ml YNB et 5 ml de milieu de glucose à 20%, de telle sorte que le diamètre extérieur est d'environ 600 à 0,1. Croître dans des erlenmeyers de 250 ml dérouté à 250 rpm, 30 ° C dans un incubateur orbitale secouant jusqu'à ce que la DO 600 atteigne 1. Séparer la culture entre deux Erlenmeyer de 2 l dérouté flacons contenant chacun 450 ml YNB et 25 ml de milieu glucose à 20%. Cultiver ces sur à 250 rpm, 30 ° C dans un incubateur orbitale secouant jusqu'à ce que la DO 600 atteint 1,2. Alors que ces cultures sont de plus en plus pré-, mis en place dans le fermenteur. Assurez-11.2l de YNB que visées au point 1.1, mais elles se dissolvent supplémentaires 8,28 g et 0,95 YNB goutte à g supplément pour compenser l'ajout de glycérol à l'induction. Ajouter stérilement le 11,2 l YNB et 75 ml de milieu de glucose à 20% à une cuve de fermentation 20l stérile et ajuster la température de fonctionnement de30 ° C. Ajouter stérilement les précultures dans le fermenteur et définir la vitesse d'agitation à environ 800 tours par minute et maintenir la température à 30 ° C. L'air comprimé doit couler à environ 15 dm 3 min -1. Une fois que la culture du fermenteur atteint une DO 600 de 1,2, induire en ajoutant aseptiquement 1,5 l YNB solution de galactose à 20% de glycérol et 1,2 l. Réduire la température à 25 ° C et faire croître la culture pendant 16 heures. Transférer le contenu du fermenteur dans des pots à centrifuger réfrigérés 1l sur la glace à l'aide d'une pompe péristaltique. Récolter les cellules par centrifugation à 3500 xg, 4 ° C pendant 30 minutes dans un rotor de grande capacité (par exemple 6 litres). Remettre en suspension les cellules dans 150 ml de glace CRB froid avec inhibiteurs de la protéase. A partir de là, tout travail doit être effectué à 4 ° C. Lyse des cellules en passant par un perturbateur des systèmes à pile constante en 4 passages à 25, 30, 32 et 35 kPa, la collecte du lysat sur la glace dans chaque cas. Sinon, utilisez un cordon de Beater (Biospec) avec un volume égal d'acide à la chaux des perles de verre de 0,5 mm et agiter pendant 3 minutes à pleine puissance. Transférer le lysat à 50 ml tubes Falcon et le culot les débris cellulaires par centrifugation à 3500 xg, 4 ° C pendant 15 minutes dans une centrifugeuse de paillasse. Transférer le surnageant dans des tubes à centrifuger réfrigérés. Centrifuger à 14000 xg, 4 ° C pendant 30 minutes dans une centrifugeuse pour éliminer les mitochondries. Transférer le surnageant dans des tubes réfrigérés ultracentrifugeuse. Centrifuger à 200 000 xg, 4 ° C pendant 90 minutes dans une ultracentrifugeuse à recueillir des microsomes. Décanter avec soin et jeter le surnageant et ajouter 2 ml de tampon CFTR glacée avec les inhibiteurs de protéase et 1 mM DTT à chaque tube. Resuspendre doucement les boulettes à l'aide d'un pinceau, faire l'appoint de chaque tube avec un tampon de CFTR et mélanger à l'aide d'un mélangeur vortex. Centrifuger la suspension à 200.000 xg, 4 ° C pendant 60 minutes dans une ultracentrifugeuse, jeter des boulettes surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de glace froide CFTR w tamponinhibiteurs de la protéase vec (Pas de TNT) à l'aide d'un pinceau. Piscine des microsomes remises en suspension, ajuster le volume final à 50 ml avec du tampon CFTR et bien mélanger. Réserver une aliquote de 1 ml pour analyse sur gel SDS-PAGE, tel que décrit dans 02.09 à 02.11. Les microsomes peuvent maintenant être éclair congelés dans l'azote liquide puis conservés à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire. CFTR peut être extraite de microsomes avec l'une des détergents suivants: lithium perfluorooctonoate acide (LiPFO), tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycérol (LPG14), le n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM). Mélanger les microsomes avec un tampon de CFTR, inhibiteurs de la protéase et 5% de détergent (w / w). Si DDM est utilisé, ajouter 300 mM de NaCl à la mémoire tampon. Agiter à 4 ° C pendant 15 minutes sur un rotateur tube. Centrifuger les échantillons à 100.000 xg, 4 ° C pendant 1 heure dans une ultracentrifugeuse. Conserver le surnageant et prendre une petite partie aliquote d'analyse sur gel de SDS-PAGE. CFTR peut désormais être purifié à partir du matériau solublised par le métal immobiliséchromatographie d'affinité suivie par chromatographie d'exclusion stérique. 4. Les résultats représentatifs Transformation de la levure avec le plasmide contenant la protéine CFTR n'est pas efficace à 100%. Un représentant de petite échelle de l'écran d'expression de CFTR dans les colonies sélectionnées à partir d'une expérience de transformation devrait rapporter environ 1 à 4 colonies exprimant la protéine. Un résultat typique d'un écran de 5 colonies sélectionnées dans une plaque est montré dans le panneau A de la figure. 3. L'une des colonies montre un fort niveau d'expression de la protéine de fusion GFP-CFTR, qui dure généralement entre les 250 kDa et 130 kDa marqueurs, comme le montre. Les niveaux de la protéine CFTR-fluorescence de la GFP peut varier considérablement entre les expériences, avec la colonie 4 sur la figure. 3 démontrant de fluorescence d'au moins 10x plus grande que la bande intrinsèque fluorescente à environ 70kDa. Si les niveaux d'expression de la protéine CFTR-GFP semblent donner moins de fluorescence de la bande de 70 kDa, alors il vaut probablement la peine re-transformant et en choisissant une colonieavec des niveaux plus élevés de la protéine CFTR-GFP expression. Comme le montre la Fig. 3A, il est peu probable, même avec un haut niveau d'expression de la protéine CFTR-GFP, que la bande CFTR-GFP sera perceptible dans l'extrait cellulaire par coloration au bleu de Coomassie. Une fois sélectionnés les colonies ont été cultivés dans des expériences à plus grande échelle, et les microsomes isolés, la présence de la protéine CFTR-GFP dans les microsomes devront être évalués, comme indiqué dans la Fig. 3B. Les résultats de cette expérience sont importants, non seulement pour évaluer l'efficacité de l'induction de l'expression, mais aussi de vérifier que les microsomes ont été préparés avec soin et que la protéolyse a été minimisé. Les résultats présentés dans la figure. 3B entendre que, dans cette expérience, l'expression du CFTR-GFP est légèrement inférieur (à en juger par rapport à la bande intrinsèque 70kDa) que dans l'expérience à petite échelle montré dans le panneau A. Cependant, cette impression est biaisée par la surexposition du détecteur de fluorescence dans ce mesure. C'est parce que l'expérimentateur était checking pour détecter la présence de fragments protéolytiques de la CFTR construire. Il existe certaines preuves dans cette expérience pour certains fragments fluorescents protéolytiques entre les 130 kDa et 100 kDa marqueurs, mais ceux-ci sont très faibles par rapport à la pleine longueur CFTR-GFP bande. Avec les inhibiteurs de la protéase décrite ici, nous trouvons peu de preuves de la dégradation protéolytique de la protéine CFTR après la rupture des cellules. Si la protéolyse significative n'est observée, nous recommandons de faire de nouvelles solutions inhibiteurs de la protéase d'achat d'actions. Nous avons également constaté que les comprimés commerciaux inhibiteurs de la protéase cocktails ne sont pas aussi efficaces pour ce système. La croissance des cellules au-delà de 16 heures (post-induction) donnera lieu à l'expression du CFTR a diminué comme le montre la figure 4. Cela est probablement dû au chiffre d'affaires de la protéine, peut-être dû à une régulation positive de la machinerie de la levure de protéines contrôle de la qualité 6-9,13. Il est donc conseillé de surveiller les niveaux d'expression du gène CFTR, après induction par le galactose, si possible, que le moment optimal pour récolter les cellules may varient d'un laboratoire à l'autre. Figure 1. Le CFTR construction contenant plasmide de levure. La fusion du CFTR-GFP-8His est inséré dans le vecteur d'expression 2μ p424GAL1, sous le contrôle d'un galactose (GAL1) promoteur. Le vecteur contient également un marqueur de sélection uracile (URA) et un gène de résistance à l'ampicilline (Amp). Figure 2. Un organigramme résumant le protocole visualisées. Figure 3. Représentant gels SDS-PAGE de l'expression du CFTR et la purification. Groupe A, montre que cinq choisi au hasard colonies transformantes (voies 1-5) qui ont été criblés pour l'expression du CFTR. Le panneau B montre microsomes qui ont été isolés à partir d'un ferm 15lentrer la culture. Groupe C montre purifié la protéine CFTR murin obtenu après deux étapes de purification à l'aide de chromatographie d'affinité suivie par chromatographie d'exclusion stérique. Tous les gels sont présentés dans des conditions d'éclairage par fluorescence passionnante du domaine GFP (à gauche) et après Coomassie tacher (à droite). Les positions relatives des standards de poids moléculaire sont indiqués sur la gauche (kDa). Figure 4. Les données représentatives pour l'expression de la protéine CFTR chez la levure. Le panneau A montre un temps bien sûr de l'expression du CFTR après induction par le galactose. Des extraits cellulaires ont été analysés par SDS-PAGE, et la fluorescence de la GFP pour la bande protéine CFTR-GFP a été intégré. B Panel montre des résultats typiques pour la microscopie de fluorescence de la GFP cellules exprimant induction 16 h après. En règle générale, seule une fraction des cellules expriment la protéine CFTR à des niveaux élevés.