Bir Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Kullanarak İnsan Plazma Faktör V Aktivitenin Ölçümü
Summary
Bu çalışma daha önce bildirilmemiştir insan plazma fibrin pıhtı oluşumu sırasında FV koagülasyon aktivitesini ölçer bir roman mikroplate assay açıklanır. Yöntem sürekli olarak insan plazması içinde fibrin pıhtısı oluşumu sırasında 405nm de absorbans değişikliği ölçmek için bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanır.
Abstract
Hasarına yanıt olarak, kan pıhtılaşma aktive edilir ve pıhtılaşma proteaz, trombin oluşumu ile sonuçlanır edilir. Fibrinojenin Trombin parçalayarak fibrinojen hangi kanama durur çözülmeyen bir pıhtı oluşturur. Onun aktif formu, FVa, faktör V (FV) protrombinaz 1, 2 bir parçası olarak fibrin pıhtısı oluşumu sırasında Trombin üretiminin proteaz FXa ve hızlandırıcı için kritik bir kofaktörüdür. Manuel FV deneyleri 3, 4 tarif edilmiştir, ancak zaman alıcı ve subjektiftir. Otomatik FV deneyleri 5-7 bildirdi, ancak analiz ve reaktifler pahalı ve genellikle sadece pıhtı zamanı değil, fibrin oluşumunun hızı ve kapsamı sağlamak vardır oylandı. Mikroplak platformu nedeniyle kolaylık enzim-katalizli olayları ölçmek için tercih edilir, zaman, maliyet, küçük hacimli, sürekli izleme ve 9, 8 yüksek verimli. Mikroplaka deneyleri pıhtı lizis 10, trombosit agregasyon bildirilmiştir11, 12 ve pıhtılaşma faktörleri, fakat insan plazma FV faaliyeti için. Yöntemin amacı, insan plazma içinde fibrin oluşumu sırasında FV aktivitesini ölçer bir mikroplaka tahlil geliştirmektir.
Bu roman mikroplak yöntemi insan plazmasında FV faaliyet basit, ucuz ve hızlı bir tahlil özetliyor. Tahlil, insan plazması içinde fibrin formasyonu (Şekil 1) 13 boyunca 405nm de absorbans değişikliği izlemek için bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanmaktadır. Tahlil doğru zaman, ilk oran ve fibrin pıhtısı oluşumu ölçüde ölçer. Bu plazma sadece ul miktarda gerektirir 6 dakika içinde tamamlandıktan sonra, yüksek verimli olan, 24-80pM FV hassastır ve miktarını ölçer istem aktif (1-evre aktivite) ve trombin ile aktive FV (2-kademeli etkinlik 1-grup etkinliği) -), toplam işlevsel aktivitesini tam bir değerlendirmesi (2-kademeli etkinlik elde edilir.
Dissemine intravaskülerküler pıhtılaşma (DIC) genellikle önceden varolan enfeksiyonlar 14 gelişir bir kazanılmış koagülopati olup. DIC evvelce mevcut patolojinin 15 üzerinde bir kötü prognozu ve mortalitesi ile ilişkilidir. Tahlil DIC, FV 1-kademeli, 2-aşamalı ve toplam faaliyetleri ile 9 hastada normal toplanmış insan ile karşılaştırıldığında, sırasıyla,% 54,% 44 ve% 42, ortalama düşüş olduğunu göstermek için kullanılan Referans plazma (NSP).
FV mikroplate assay herhangi bir pıhtılaşma faktörü aktivitesini ölçmek için kolayca adapte edilebilir. Bu test, araştırma ve klinik ortamlarda faaliyetinin daha doğru ve tam bir ölçüm yoluyla FV biyokimya anlayışımızı artacaktır. Bu bilgiler pozitif erken tanı ve böyle DIC gibi pıhtılaşma bozuklukları, daha etkili tedavilerin geliştirilmesi yoluyla sağlık ortamları etkileyecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kinetik mikroplate assay yöntemi bir roman, yok (FV 1-aşamalı yöntem) veya insan plazma örnekleri FV koagülasyon aktivitesi ölçümü için, hızlı, ucuz ve uygun tekniğin gelişimi özetliyor bilerek katma trombin (FV ile aktive edilmiştir 2-aşamalı yöntem). Tahlil, bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanır ve gerekli olan tüm malzemeleri ve reaktifler, ticari olarak temin edilebilir ya da in-house yapılabilir. Tahlil sürekli 405nm de fibrin pıhtı oluşumu sırasında plazma ışık saçma değişikliğini takip. Mikroplate assay küçük plazma numune hacimleri (ul) kullanmanın avantajı vardır ve aynı anda birden fazla örnekleri (12) analizi için müsait olduğunu. Pahalı ekipman ve reaktifler (Otomatik analizör ve Faktör-eksik plazmalar) kullanıldığında bu tahlil öznitelikler avantajlıdır; sadece küçük bir örnek hacimleri mevcuttur (Hasta plazmalar) veya FV arıtma f sırasında örnekleri çok sayıda (analizrom plazma).
FV mikroplaka tahlil, hızlı ve uygun olduğu ilave avantajlara sahiptir, ve gerekli kurucu bileşenlerin izolasyon ve saflaştırma gerekli değildir. Manuel eğim tüpü 3, 4 ve rapor edilmiştir otomatikleştirilmiş 5-7 FV testleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplate assay pıhtı kez karşılaştırılabilir yararlı aralığı (25-75 sn) ve örnek gelen FV düzeyleri (0,5-,005 Birimleri var / ml) ve duyarlılık / algılama sınırları (20-80pM). Pıhtı oluşumunu 3, 4 öznel bir görsel değerlendirme muzdarip manuel eğim-tüp FV deneyleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplate assay pıhtı zaman objektif ve kantitatif ölçümü, başlangıç hızı, ve fibrin pıhtı oluşumu ölçüde izin verir. 5-7 pahalı analizörleri ve reaktiflerin gereksinimi muzdarip otomatik FV testleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplak test reaktifleri ve malzeme ucuz ve gerekli tüm malzemeleri purcha olabilirticari sed veya evde yapılmış. Elle eğim tüpü 3, 4 ve otomatik 5-7 FV deneyler genellikle sadece pıhtı oluşumu için zaman sağlanır; değil süresi, başlangıç hızı, ve tüm doğru FV mikroplate assay ile spektrofotometrik olarak ölçülür fibrin pıhtısı oluşumu derecesi. Son olarak, 3,4 eğim tüpü manuel ve otomatik 5-7 FV deneyleri sadece plazma örnekleri bir defada biri FV aktivitesini ölçmek edememek muzdarip; FV mikroplate assay high-throughput mükellef olup 12 örnek olabilir oysa aynı anda test.
Mikroplaka tahlil 9 DIC hasta plazmalardaki FV çünkü gecikmeli pıhtı kez ve FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu daha düşük başlangıç oranları bir bileşimi NHP içinde daha az aktif olduğunu göstermek için kullanılmıştır. DIC hasta plazmalarda FV 2-aşamalı yöntem pıhtı oluşumunun başlangıç hızları NSP değişti değildi. DIC patien içinde pıhtı oluşumu uzantılart plazmalar da FV 1-evre ve 2 aşamalı deneylerde NSP değişti değildi. FV Azalmış 1-kademeli, 2-aşamalı ve toplam faaliyetleri bu kazanılmış kan bozukluğu patogenezinde sırasında diğer çalışmalara göre artan FV tüketimi 19 ve / veya inaktivasyonu 6 nedeniyle olmuş olabilir. DIC Plazma içinde pıhtı oluşumu dereceye kadar NHP ile gözlenen aynı olduğu göz önüne alındığında, bu değişken en FV-eksik plazma fibrinojen konsantrasyonu sonucunda muhtemel ve hastanın plazmasının özellikleri ile ilgili değildir.
Mikroplak tahlilinden gelen sonuçlar, insan plazma örnekleri içinde FV aktivite ölçümü FV 1-aşamalı yöntem gelen pıhtı oluşumu zamanı ve başlangıç hızı ve FV 2 pıhtı oluşumu ve toplam aktivite süresi elde edilebilir belirtilmedikçe – aşamalı yöntem. Bu t pıhtı oluşumu ölçüde dayalı bir plazma örneği FV aktivitesinin kantitatif ölçümü elde etmek mümkün değildio FV 1 – ve 2 aşamalı deneyleri ya da FV 2-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumunun başlangıç hızı. Tüm reaksiyonlar yaklaşık 0.35 pıhtı oluşumu aynı ölçüde ulaştı Verilen – öncesi başlangıç absorbansı ve tromboplastin ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra maksimal absorbans arasındaki 0.45 Üniteleri, pıhtı oluşumu ölçüde ölçümü FV aktivitesinin kantitatif değerlendirmesini sağlamaz plazma örneği verilmiştir.
Roman mikroplate assay insan ve hayvan plazma kendi arıtma sırasında insan plazma ve kesirler örnekleri FV aktivitesi ölçümü için araştırma ve klinik ortamlarda kullanımı bulacaksınız. Mikroplate assay zaman, ilk oran ve pıhtı oluşumunu ölçmek için kullanılmaktadır edilebilir; parametreler, genellikle manuel eğim tüpü deneyleri ve otomatik analiz eş zamanlı olarak pıhtılaşma denetlenmemektedir. Bu bilgiler, pıhtı oluşumu olay sırasında FV tutulumu tam bir nicel değerlendirmenin fazlasını sağlarinsan plazması içinde daha önceden 3-7 rapor edilmiştir. Plazma örneklerinde FV aktivite veya FV veya FVa saflaştırılmış ile önemli değişiklik ölçerken Bu bilgiler araştırma ve klinik laboratuvarlarda hem de özellikle önemlidir. FV mikroplate assay da belirlerler ve ölçmek FV ve FVa etkinleştirmek veya inaktive olabilir bileşikler, venöz tromboz riski olan hastalarda FV aktivitesini ölçmek mutasyonun bir sonucu olarak 20, 21 ve etkinliğini izlemek için kullanılan olabilir plazmadan kendi arıtma sırasında FV.
FV mikroplate assay uygun etken eksikliği olan plazma kullanılarak ve fibrin oluşumunun başlatılması için reaktifler dış, içsel, ya da ortak bir yoldan herhangi bir pıhtılaşma faktörü etkinliği ölçmek için kolaylıkla uyarlanabilir. Tahlil araştırma ve klinik laboratuvarlar faaliyetinin daha doğru ve eksiksiz bir ölçüm yoluyla FV biyokimya anlayışımızı artacaktır. Nihaily, bu bilgiler pozitif erken tanı ve böyle DIC gibi koagülasyon bozuklukları ile tutulmuş bireyler için daha etkili tedavilerin geliştirilmesi yoluyla sağlık ortamları etkileyecektir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma Mesleki Gelişim ve Araştırma Başlatma Fonları Teknoloji Ontario Enstitüsü (UOIT) arasında Üniversitesi'nden Dr John A. Samis ve Irina Levit için Sağlık Araştırması Sağlık Profesyonel Öğrenci Araştırma Ödülü Kanadalı Enstitüleri ile desteklenmiştir. Yazarlar videoyu hazırlarken ona yardım için Shannon Everett (Öğretme ve Öğrenme Merkezi, UOIT) kabul etmektesiniz. Yazarlar kendi rehberlik, içgörü ve yararlı tartışmalar için Dr Michael E. Nesheim (Biyokimya Anabilim Dalı, ON Queen Üniversitesi, Kingston) kabul etmektesiniz. Yazarlar ayrıca çalışmada kullanılan DIC hasta plazmaları sağlamak için Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hemostaz ve Tromboz Merkezi, Royal Liverpool Üniversite Hastanesi, Liverpool, İngiltere) kabul etmektesiniz.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
| Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
| Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
| Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
| EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
| FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
| 3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
| Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
| HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
| Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
| Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
| Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
| Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
| ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
| 1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
| Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |
References
- Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
- Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
- Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
- Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
- Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
- Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
- Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
- Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
- Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
- Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
- Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
- Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
- Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
- Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
- Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
- Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
- Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
- Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
- Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
- Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
- Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).
