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면역학 및 감염병학

La mesure de l'activité du facteur V dans le plasma humain en utilisant un test de coagulation microplaques

Published: September 09, 2012
doi:
10.3791/3822
, ,
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science,University of Ontario Institute of Technology , 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences,University of Ontario Institute of Technology , 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences,University of Ontario Institute of Technology

Summary

Cette étude décrit un essai de microplaque roman qui mesure l'activité de coagulation FV lors de la formation du caillot de fibrine dans le plasma humain qui n'a pas été signalé précédemment. Le procédé utilise un lecteur de microplaques cinétique de mesurer en continu la variation de l'absorbance à 405 nm lors de la formation du caillot de fibrine dans le plasma humain.

Abstract

En réponse à la blessure, la coagulation du sang est activé et entraîne la production de la protéase de coagulation, la thrombine. La thrombine clive le fibrinogène en fibrine qui forme un caillot insoluble qui arrête l'hémorragie. Facteur V (FV) dans sa forme activée, FVa, est un co-facteur critique pour la protéase Xa et accélérateur de génération de thrombine au cours de la formation du caillot de fibrine dans le cadre de prothrombinase 1, 2. Manuel des tests FV ont été décrits 3, 4, mais elles prennent du temps et subjective. FV automatisés tests ont été rapportés 5-7, mais l'analyseur et des réactifs sont coûteux et généralement fournir que le temps de coagulation, et non le taux et l'étendue de la formation de fibrine. La plate-forme de microplaques est préférable pour mesurer catalysées par des enzymes événements raisons de commodité, le temps, le coût, faible volume, la surveillance continue et à haut débit 8, 9. Tests en microplaques ont été rapportés pour 10 lyse du caillot, l'agrégation plaquettaire11, facteurs de coagulation et 12, mais pas pour l'activité FV dans le plasma humain. L'objectif de la méthode est de développer un test qui mesure l'activité de microplaques FV au cours de la formation de fibrine dans le plasma humain.

Cette méthode en microplaque roman décrit un test simple, peu coûteux et rapide de l'activité FV dans le plasma humain. Le dosage utilise un lecteur de microplaques cinétique de suivre l'évolution de l'absorbance à 405 nm lors de la formation de fibrine dans le plasma humain (figure 1) 13. Le test mesure avec précision le temps, le taux initial et le degré de formation d'un caillot de fibrine. Elle exige que des quantités ul de plasma, est complète en 6 minutes, a haut débit, est sensible à la 24-80pM FV, et mesure la quantité d'actionnement involontaire (1-étape de l'activité) et la thrombine activée par FV (2-phase d'activité ) pour obtenir une évaluation complète de son activité fonctionnelle totale (2-phase d'activité – 1-étape de l'activité).

Intravasculaire disséminéeculier la coagulation (CIVD) est une coagulopathie acquise que développe le plus souvent à partir maladies infectieuses préexistantes 14. DIC est associée à un mauvais pronostic et la mortalité augmente au-dessus de la pathologie préexistante 15. Le test a été utilisé pour montrer que chez 9 patients avec DIC, le FV 1-phase, 2 étages, et des activités totales ont diminué, en moyenne, de 54%, 44% et 42%, respectivement, par rapport à la normale de l'homme mis en commun plasma de référence (PSN).

Le test FV microplaque est facilement adaptable pour mesurer l'activité de toute facteur de coagulation. Ce test permettra de mieux comprendre la biochimie de la VF par une mesure plus précise et plus complète de son activité dans la recherche et les milieux cliniques. Cette information aura un impact positif environnements de soins de santé grâce à un diagnostic plus précoce et au développement de traitements plus efficaces pour les troubles de la coagulation, tels que DIC.

Protocol

1. Préparation de la VF-plasma humain déficient Cette méthode est une modification de la procédure décrite à l'origine par Bloom et al 4. Obtenir sang humain total d'un bénévole adulte en bonne santé consentants (Homme ou Femme, 18 ans – 50 ans) qui n'est pas de prendre tout médicament. Porter des gants en latex et un sarrau tout au long de la procédure. Préparer 100 ml de 3,2% (p / v) de citrate trisodique dans de l'eau distillée. Chargez 6,0 ml de cette solution dans 60 seringues distinctes ml. Retirer l'air par appuyer sur le piston jusqu'à la marque attentivement 6,0 ml sur la seringue. Utilisez un tampon imbibé d'alcool pour nettoyer la zone de la veine cubitale entre biceps et l'avant-bras. Connect 20 appareils papillon jauge pour une seringue de 3 ml. Insérez l'aiguille dans la veine cubitale papillon et tirer doucement sur le piston jusqu'à ce que le sang remplit la barre des 3 ml. Jeter la seringue avec du sang. Cette étape est réalisée pour éliminer tout facteur tissulaire libéré de l'endothélium endommagé à l'aiguillesite de la lésion qui peut activer le processus de coagulation et d'interférer avec la préparation de plasma déficient en FV. Connectez aiguille à ailettes à «chargé» avec 60 ml seringue citrate trisodique 6,0 ml et tirer doucement sur le piston jusqu'à ce que le sang atteint la marque de 60 ml sur la seringue. (Final 10.9mm concentration de citrate). Retirer la seringue de l'aiguille papillon et mélanger délicatement la seringue tout en gardant un doigt ganté ou le pouce sur la sortie de la seringue. Continuer le prélèvement de sang en 60 seringues ml chacune remplie de 6,0 ml de citrate trisodique 3,2% tel que décrit ci-dessus. Il faut prévoir la récupération d'environ 50% du volume de sang citraté que le plasma après centrifugation et que 50 pl de plasma déficient en FV est nécessaire par exemple dans le test microplaque. Notre laboratoire traite régulièrement 300-420 ml de sang citraté à la fois avec 7.5 x 60 seringues ml chacun avec 6,0 ml de citrate trisodique 3,2% / seringue. Cela est suffisant FV plasma déficient pour environ 3.000 microessais sur plaque (voir ci-dessous). Retirer l'aiguille du bras de papillon bénévole et appuyez sur une compresse de gaze stérile sur le site de la ponction veineuse pour 1,0 min. Couvrir site de ponction de la veine d'un pansement stérile. Centrifuger le sang citraté à 3300 xg pendant 20 min à température ambiante. Récupérer la couche supérieure de plasma jaune dans un bécher en plastique avec un barreau d'agitation à l'aide d'une pipette de transfert en plastique en prenant soin de ne pas déranger la couche inférieure rouge et blanc de cellules de sang. Mesurer le volume de plasma en ml et conserver 100 ul de plasma EDTA avant l'addition de la glace pendant le temps de prothrombine caillot avenir (PT) test (voir ci-dessous). Ajouter lentement solide EDTA à plasma citraté sous agitation douce à température ambiante pour atteindre 5 mM (concentration finale). Une fois que l'EDTA est dissous, ajuster le pH à 7,0 par addition goutte à goutte de NaOH 1,0 M sous agitation douce. Couvrir le bécher avec Saran Wrap et incuber pendant 8-10 heures sans agitation à 37 ° C. Chaque h 2, de récupérer 100 ul d'le plasma EDTA-traitée sur de la glace et de déterminer le terminal au moment de l'incubation avec l'EDTA et le comparer à PT de plasma avant l'addition d'EDTA (voir ci-dessus). Pour les déterminations PT, amovibles se placent 8 bandes immunomodule ainsi en porte-gabarit en plastique et l'insérer dans un lecteur de microplaques. Bandes immunomodule Orient dans un lecteur de microplaques que: vide, vide, échantillons, vide, vide, échantillons, vides, vides et de gauche à droite dans le porte-modèle pour minimiser les interférences diffusion de la lumière à partir voisins échantillon contenant des bandes. En outre, n'utilisez que des puits 2-7 de haut en bas dans chaque bande 8 immunomodule bien pour minimiser les interférences diffusion de la lumière par les bords des porte-gabarit en plastique. Le dosage FV microplaque est capable de mesurer la formation de caillots de fibrine dans au moins 12 échantillons différents simultanément (6 échantillons par bande immunomodule plus 2 bandes immunomodule). En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 50 ul de HBS (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) àchaque puits de microplaque pour chacun des échantillons à doser. En utilisant une pipette simple, ajouter 50 ul d'un pool de plasma humain normal de référence (PSN) ou le plasma avant l'addition de l'EDTA ou à différents temps d'incubation après addition d'EDTA pour séparer les puits de la microplaque. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 50 ul de thromboplastine (Voir ci-dessous pour la méthode de préparation) à tous les puits de la microplaque avec plasma à doser. Incuber dans un lecteur de microplaques à 25 ° C pendant 1 min et le programme du lecteur de microplaques à agiter la plaque pendant le sec 15-25 de l'incubation de 1 min. Utilisation de l'ordinateur interfacé avec le lecteur de microplaques, accès SoftMax logiciel Pro microplaque application. Réglez le lecteur d'absorbance, longueur d'onde 405 nm à, mode cinétique, la température à 25 ° C, et le programme du lecteur de microplaques à agiter pendant 5 sec, et lire l'absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 6 min. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter du chlorure de calcium (50 ul de 25 mM dans de l'eau distillée; 2.1mm final Concentration) à tous les puits de la microplaque, attendez 15 secondes, puis appuyez sur "Démarrer" icône sur le menu microplaque SoftMax Pro pour commencer le test. Déterminer la TP à partir des profils d'absorbance en fonction du temps dans SoftMax Pro comme le temps pour atteindre l'augmentation d'un demi maximum d'absorbance à 405 nm (Le point médian de la courbe d'absorbance sigmoïde vs Temps produite après la thromboplastine et plus de chlorure de calcium. Voir ci-dessous, Figure 1). Calculer la FV 1-degré d'activité de l'heure Clot Connexion (s) en fonction de Log FV activité (unités / ml) comme illustré ci-dessous dans la figure 2A. À des fins de quantification, 1 unité d'activité est définie comme FV l'activité présente dans 1,0 ml PSN avant l'activation intentionnelle avec la thrombine ajoutée (voir ci-dessous, le dosage des échantillons de plasma humain à l'étape 1-FV et le 2-étape de test de coagulation microplaque). Préparer 4.0l 20 mM d'HEPES contenant 0,15 M de NaCl dans de l'eau distillée en agitant doucement. Ajuster le pH à 7,4 avec dropw lenteplus de 5,0 M ise NaOH (HBS, pH 7,4). Obtenir une longueur suffisante de tube à dialyse et bien rincer avec de l'eau distillée. Faire un nœud à une extrémité de la tubulure. Transfert EDTA plasma traité par un tube de dialyse avec une pipette de transfert en plastique, retirer l'air et faire un noeud à l'autre extrémité du tube. Soigneusement accrocher le plasma EDTA-traitée dans le tube dans le HBS avec agitation douce. Couvrir avec le Saran Wrap et dialyser pendant 14-16h sous agitation douce à 4 ° C. Retirez délicatement le plasma EDTA-treated/dialyzed en aliquots de 3,0 à 15,0 ml tubes à vis ml plafonnés et conserver 100 ul pour analyse de PT de «finale» FV plasma déficient sur de la glace. Stocker le plasma déficient en FV-à -80 ° C jusqu'à utilisation. Dans les conditions décrites ci-dessus, l'augmentation des TP de 10 à 15 secondes avant l'addition d'EDTA à 90-100 sec 8-10 h après l'addition d'EDTA. Le plasma déficient en FV préparé par ce procédé contient habituellement moins de 0,1% de l'actif présent dans le FV départplasma humain frais. 2. Préparation de thromboplastine Dialyse est nécessaire pour éliminer toute calcium à partir de ce réactif de manière à permettre la formation de caillots de synchronisation précisément fibrine à partir du moment de l'addition du chlorure de calcium pour initier la coagulation processus. Préparer 100 ml et 4.0l de HEPES 20 mM et NaCl 0,15 M dans de l'eau distillée dans un bécher en plastique avec agitation douce. Ajuster le pH à 7,4 en ajoutant goutte à goutte lent de 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4). Ajouter 6,0 ml de HBS, pH 7,4 à chaque flacon de réactif thromboplastine, replacer le couvercle et secouer doucement pour dissoudre. Incuber en flacons capsulés réactif pendant 15 min à température ambiante pour dissoudre la matière séchée. Agiter doucement pour dissoudre complètement. Couper une longueur suffisante de tube à dialyse, bien rincer avec de l'eau distillée, et attacher une extrémité du tube avec un noeud. Transfert thromboplastine un tube de dialyse, retirer l'air, et attacher l'autre extrémité du tube avec un noeud. Californierefully accrocher un tube de dialyse dans 4.0l de HBS, pH 7,4 et remuer doucement recouvert de Saran Wrap à 4 ° C pendant 14-16 heures. Transfert 3,0 ml de la thromboplastine dialyse des tubes de 15 ml plafonnés à vis et conserver à -80 ° C jusqu'à leur utilisation. 3. Préparation des FV 1-étape de coagulation microplaques standard Courbes dosage de l'activité Décongeler FV plasma déficient, PSN, et la thromboplastine à 37 ° C pendant 10 min. Mélanger délicatement FV plasma déficient et de thromboplastine indépendamment, transfert à séparer en plastique bacs de rinçage, et incuber sur de la glace. Rangez le PSN sur la glace après avoir délicatement le mélange. Chlorure de calcium magasin (25 mM dans de l'eau distillée) dans un bac de lavage séparé à la température ambiante. Préparer 200 pi chacun des 2-dilutions de produits de santé naturels de 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512 fois dans du HBS, pH 7,4 avec 1,5 microtubes ml. Vortex et incuber sur de la glace. Placez 8 bandes amovibles immunomodule ainsi en pPorte modèle de Lastic et l'insérer dans un lecteur de microplaques. Bandes immunomodule Orient dans un lecteur de microplaques que: vide, vide, échantillons, vide, vide, échantillons, vides, vides et de gauche à droite dans le porte-modèle pour minimiser les interférences diffusion de la lumière à partir voisins échantillon contenant des bandes. En outre, n'utilisez que des puits 2-7 de haut en bas dans chaque bande 8 immunomodule bien pour minimiser les interférences diffusion de la lumière par les bords des porte-gabarit en plastique. Le dosage FV microplaque est capable de mesurer la formation de caillots de fibrine dans au moins 12 échantillons différents simultanément (6 échantillons par bande immunomodule plus 2 bandes immunomodule). Allumez le lecteur de microplaques et l'accès SoftMax Pro logiciel de microplaques. En utilisant une pipette multicanaux, faire des ajouts simultanés de plasma déficient en FV (50 pi) à tous les puits de la microplaque échantillon. Utiliser une pipette simple, ajouter 50 ul des 10 dilutions en série de produits de santé naturels préparés ci-dessus pour séparer les puits de la microplaque. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter thromboplastine (50 pi) à tous les puits d'échantillon. Incuber dans le lecteur de microplaques à 25 ° C pendant 1 min et le programme du lecteur de microplaques à agiter la plaque pendant le sec 15-25 de l'incubation de 1 min. Utilisation de l'ordinateur interfacé avec le lecteur de microplaques, accès SoftMax logiciel Pro microplaque application. Réglez le lecteur d'absorbance, longueur d'onde 405 nm à, mode cinétique, la température à 25 ° C, et le programme du lecteur de microplaques à agiter pendant les 5 premières secondes après l'addition de chlorure de calcium, et de mesurer l'absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 6 min par la suite. L'intervalle de 5 sec secousse n'est pas incluse dans les temps caillot calculées (voir ci-dessous). En utilisant une pipette multicanaux, ajouter du chlorure de calcium (50 ul de 25 mM dans de l'eau distillée; concentration finale de 3,5 mm) à tous les puits de la microplaque échantillon, attendez 15 secondes, appuyez sur "Démarrer" icône dans l'application de microplaques en SoftMax Pro de l'ordinateur pour lancer le dosage. Til caillot fois sont calculés comme le temps en secondes pour atteindre le point médian entre l'absorbance minimale et maximale à 405 nm après la thromboplastine et plus de chlorure de calcium. Les vitesses initiales de formation du caillot est calculée comme le taux d'augmentation de l'absorbance à 405 nm (mUnits / min) qui englobent les 5 premiers points dans le temps de formation du caillot dans la partie linéaire de la courbe d'absorbance en fonction du temps. L'étendue de la formation d'un caillot a été calculé comme la différence entre l'absorbance maximale et minimale à 405 nm (unités) réalisés au cours de l'événement formation de caillots. 4. Dosage des échantillons de plasma de l'homme avec la FV 1-2-étape et l'étape de test de coagulation microplaques Décongeler FV plasma déficient, PSN, les plasmas de l'échantillon, et de thromboplastine à 37 ° C pendant 10 min. Mélanger délicatement FV plasma déficient et de thromboplastine indépendamment, transfert à séparer plateaux en plastique de lavage ELISA, et incuber sur de la glace. Stockez les produits de santé naturels plasmas et de l'échantillon sur la glaceaprès en mélangeant doucement. Chlorure de calcium magasin (25 mM dans de l'eau distillée) dans un bac de lavage ELISA séparé à la température ambiante. Préparer 200 pi chacun des 40 dilutions de plasmas produits de santé naturels et d'échantillon dans HBS, pH 7,4 avec 1,5 ml microtubes. Vortex et incuber sur de la glace. Insérez 8 bandes amovibles immunomodule ainsi dans le porte-modèle en plastique et insérez-la dans un lecteur de microplaques. Bandes immunomodule suppléant vide, vide, échantillon, vide, vide, échantillon, vides, vides et de gauche à droite dans le porte-modèle pour minimiser les interférences diffusion de la lumière à partir voisins échantillon contenant des bandes. Utiliser uniquement les puits 2-7 de haut en bas dans chaque bande afin de minimiser les interférences immunomodule diffusion de la lumière à partir des bords de support de matrice en matière plastique. Allumez le lecteur de microplaques et l'accès SoftMax Pro logiciel de microplaques. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter FV plasma déficient (50 pi) à tous les puits de la microplaque échantillon. L'utilisation d'un single pipette, ajouter 50 ul de 40 fois PSN dilué ou plasmas échantillons préparés ci-dessus pour séparer les puits de la microplaque. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter thromboplastine (50 pi) à tous les puits d'échantillon. Incuber dans le lecteur de microplaques à 25 ° C pendant 1 min et le programme du lecteur de microplaques à agiter la plaque pendant le sec 15-25 de l'incubation de 1 min. Utilisation de l'ordinateur interfacé avec le lecteur de microplaques, accès SoftMax logiciel Pro microplaque application. Réglez le lecteur d'absorbance, longueur d'onde 405 nm à, mode cinétique, la température à 25 ° C, et le programme du lecteur de microplaques à agiter pendant les 5 premières secondes après l'addition de chlorure de calcium, et de mesurer l'absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 6 min par la suite. L'intervalle de 5 sec secousse n'est pas incluse dans les temps caillot calculées (voir ci-dessous). En utilisant une pipette multicanaux, ajouter du chlorure de calcium (50 ul de 25 mM dans de l'eau distillée; 6.25mm concentration finale) à tous les puits de la microplaque échantillon et immédiatement press 'Démarrer' icône dans l'application de microplaques en SoftMax Pro de l'ordinateur pour commencer le test. A la fin de la course, déterminer le temps, le taux initial et le degré de formation de caillots de 40 fois PSN dilué et plasmas échantillons à partir des profils d'absorbance en fonction du temps dans SoftMax Pro. En tenant compte de la dilution de 40 fois, utilisez le temps de coagulation pour chaque échantillon pour calculer l'activité FV en unités / ml à partir de la courbe d'activité FV 1-étape standard de temps de coagulation en fonction de Log Log FV Activité (figure 2A). Cela représente l'activité FV-1 stade ou que, sans «intentionnelle» activation par la thrombine. Depuis FV est activée par la thrombine pour le cofacteur actif, FVa 1, un deuxième test après addition et l'incubation avec la thrombine est essentiel de mesurer avec précision la FV 2-stade activité d'un échantillon de plasma (Avec «intentionnelle» activation par la thrombine ajoutée). Pour la FV 2-phase test, préparer 200-300 ul de thrombine purifiée 18 at 100 nM dans du HBS, pH 7,4, et incuber sur de la glace. L'intention d'utiliser 10 ul de thrombine diluée pour chaque échantillon de plasma à doser avec la FV 2-phase test. Diluer 120 pi au-dessus du PSN et les plasmas d'échantillonnage de 40 fois à 100 fois avec 170 ul de HBS, pH 7,4, contenant du chlorure de calcium 2,8 mm. Ajouter 10 ul de thrombine (concentration finale 10 nM) à chaque échantillon. Vortex bien mélanger et incuber à 37 ° C pendant 1 min. Diluer l'échantillon PSN et les plasmas à 500 fois en ajoutant 400 ul de HBS, pH 7,4, puits-tourbillon, et le dosage 50 ul de chaque échantillon de plasma dans le test microplaque FV 1-étape, comme décrit ci-dessus. Déterminer le temps de coagulation pour les PSN et chaque échantillon de plasma analysés à partir des profils d'absorbance en fonction du temps dans SoftMax Pro. En tenant compte de la dilution d'un facteur 500, utilisez le temps de coagulation pour chaque échantillon pour calculer la FV 2-stade d'activité de la courbe FV 1 étage standard de temps de coagulation en fonction de Log Log FV Activité (figure 2A). Le total FV activitésté peut alors être calculée comme FV 2 étages activité – FV 1 étage activité.

Representative Results

Les résultats représentatifs – Préparation des FV 1-étape de coagulation microplaques courbes de dosage d'activité type Un exemple représentatif de la formation du caillot de fibrine dans le test FV au fil du temps généré par le lecteur de microplaques est illustré à la figure 1. Le test FV mesure avec précision le temps, le taux initial et le degré de formation d'un caillot de fibrine. Inspection des puits à l'issue test a confirmé que la formation du caillot s'est produite. Toutes les réactions ont atteint à peu près la même mesure de la formation de caillot avec un changement général de l'absorbance à 405 nm de 0,35 à 0,45 unités entre l'absorbance de départ avant et après l'absorbance maximale thromboplastine et plus de chlorure de calcium. Des exemples représentatifs des courbes d'activité FV 1-étape standard de temps de coagulation Connexion (en secondes) en fonction de Log FV activité (unités / ml) et Log Taux initial de formation de caillots (en mUnits / min) en fonction de Log FV activité (unités / ml ) pour des dilutions en série de produits de santé naturels est indiqué dans <strong> Figure 2A et 2B figure, respectivement. Montage de la parcelle Log-Log du temps Clot vs FV 1-Activité indiqué une forte corrélation entre ces variables après l'analyse de régression linéaire (figure 2A; R 2 = 0,980). Montage de la parcelle Log-Log du taux initial de formation de caillots vs Activité FV a également indiqué une forte corrélation entre ces variables après l'analyse de régression linéaire (figure 2B, R 2 = 0,983). La relation entre les deux temps de coagulation de journal et la vitesse initiale de formation en fonction de Log Clot FV activité est restée linéaire pour les PSN diluée jusqu'à 512 fois. Depuis FV circule dans les PSN à environ 12 40nm 16, le test microplaque est sensible à environ 24 80pM FV dans les PSN. Étant donné que la constante de l'interaction de FVa-FXa-lipide dans prothrombinase dissociation est d'environ 1 nM 17, le dosage FV microplaque est entièrement adapté à la mesure des niveaux de FV dans le plan physiologique pertinenplage des nM t pour la fonction FVa dans prothrombinase. En utilisant le test FV microplaque, il a été déterminé que la plage normale de l'activité dans l'essai FV FV activité 1-étape de 15 plasmas témoins sains (hommes et femmes, âge 18-20ans) était (moyenne ± écart type; Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Cette concorde bien avec l'activité normale et saine FV et la plage (0.66-1.14U/ml) déclarés par Cutler et al. pour la FV 1-étape de l'activité déterminée avec un analyseur automatique 7. La variabilité intra-essai de la durée, l'importance et le taux initial de formation de caillots dans le FV 1-étape de test dans 6 puits sur 8 jours différents a été de 3,4%, 4,4% et 3,1%, respectivement. La variabilité inter-essai de la durée, l'importance et le taux initial de formation de caillots dans le FV 1-étape de test dans 6 puits de 8 expériences différentes, réparties sur 8 jours différents a été de 7,1%, 7,8% et 9,2%, respectivement. Ainsi, la variabilité intra-et inter-essai de ces mesu troisvariables rouges était à un niveau faible et acceptable pour les performances du test robuste au sein et entre les microplaques d'essai de plusieurs échantillons simultanément (jusqu'à 12). Les résultats représentatifs – Dosage échantillons de plasma humain avec la FV 1-2-étape et l'étape de test de coagulation microplaque La courbe standard de Clot Log Time vs journal d'activité FV (figure 2A) a été utilisé pour mesurer l'activité FV dans les PSN et 9 plasmas de patients DIC qui n'ont pas été intentionnellement activé par la thrombine ajoutée (FV 1-étape de l'activité) ou ont été intentionnellement activé avec ajouté thrombine (FV 2-stade d'activité) et les résultats sont présentés dans le tableau 1. Les 9 plasmas de patients exposés DIC FV 1-scène des activités et des taux initiaux de la formation de caillots qui ont été a diminué en moyenne de 54% et 18%, respectivement, de PSN. Les degrés de formation de caillots dans le FV 1-étape de dosage dans les patients DIC ne sont pas largement différente de PSN, et a augmenté en moyenne de 13% par rapport PSN. L'activation du PSN avec de la thrombine générée une participation d'environ 8-multiplication par 2-FV degré d'activité au-dessus du FV 1-étape de l'activité (tableau 1). Ceci indique que la FV dans les PSN est principalement présent sous sa forme non activée et est d'accord avec les résultats précédemment rapportés en utilisant manuel d'inclinaison du tube tests FV 3, 4 et automatisés essais FV 5-7. Le FV 2-scène et l'activité totale ont également diminué chez les patients DIC en moyenne, de 44% et 42%, respectivement, à partir des PSN. Les vitesses initiales et les prolongements de formation de caillots dans le FV 2-phase test chez les patients DIC ne sont pas significativement différentes de produits de santé naturels, et varie en moyenne d'environ 9% et 4%, respectivement, par rapport à celle observée avec les PSN. Ces résultats indiquent que par rapport à la FV dans les PSN, le FV dans les plasmas de patients DIC a entraîné une période prolongée et une diminution du taux de formation de caillots de fibrine et que le FV patient était en moyenne, seulement 56% activable par la thrombine ainsi. ent "fo: keep-together.within pages =" always "> Figure 1. Formation de caillots dans de plasma normal de référence commun humain mesuré avec la cinétique FV microplaque test de coagulation 1-scène. Formation d'un caillot de fibrine en produits de santé naturels a été surveillée en permanence à 405 nm en utilisant un lecteur de microplaques cinétique. L'intrigue est la sortie du lecteur de microplaques d'une réaction 6 min de 32 fois PSN dilué, du plasma déficient en FV, la thromboplastine, et le chlorure de calcium dans un puits de microplaque. L'axe vertical représente la variation de l'absorbance à 405 nm qui se sont produits à la suite de la formation de fibrine dans le plasma. Le temps de la formation de fibrine a été défini comme le temps nécessaire pour atteindre l'augmentation d'un demi maximum d'absorbance ou du milieu de la courbe (36,40 s). La vitesse initiale de formation de caillot a été défini comme le taux de variation de l'absorbance à 405 nm au cours des 5 premiers points dans le temps de l'augmentation linéaire de la partie de la courbe d'absorbance (611,88 mUnits / min). L'exTente de formation du caillot est définie comme la différence entre l'absorbance maximum et minimum à 405 nm (0,35 unités). Figure 2. Courbes standard de temps et de vitesse initiale de formation de caillots vs activité du facteur V de plasma normal de référence commun humain en utilisant le test microplaque FV 1-scène. PSN a été dilué en série (0 – 512 fois dans HBS) et testés avec le test microplaque FV 1-étape, comme décrit dans le protocole. Log-Log parcelles du temps et de vitesse initiale de formation de caillots vs activité FV FV dans le test microplaque 1-étape sont présentés après un modèle de régression linéaire des données dans les parties A et B, respectivement. Échantillon Activité essai 1-étape (unités / ml) Mesure test 1-étape (unités) <td> 1-étape de test Taux initial (mUnits / min) Activité d'essai à 2 étages (unités / ml) Mesure d'essai à 2 étages (unités) Taux d'essai 2-Phase initiale (mUnits / min) L'activité totale (unités / ml) PSN 1,02 0,363 744,96 7,93 0,433 375,84 6,91 Patient 1 0,36 0,404 583,80 3,84 0,432 249,96 3,48 Patient 2 0,67 0,416 704,04 5,28 0,469 323,16 4,61 <strong> Patient 3 0,31 0,435 562,08 3,92 0,453 294,96 3,61 Patient 4 0,39 0,435 617,04 4,14 0,462 372,60 3,75 Patient 5 0,73 0,401 641,40 5,91 0,433 354,24 5,18 Patient 6 0,45 0,403 600,72 4,16 0,445 393,96 3,71 Patient 7 0,49 0,395 575,40 4,89 0,449 357,48 4,40 Patient 8 0,19 0,448 489,00 2,89 0,450 330,48 2,70 Patiente 9 0,64 0,423 699,48 5,11 0,455 417,24 4,47 Tableau 1 Activité FV dans les PSN et dans 9 patients qui ont développé la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). La FV 1-phase, 2 étages, et l'activité totale dans les PSN et 9 plasmas de patients DIC ont été déterminées à partir de la FV 1-étape de test microplaque standard courbe du temps de formation du caillot vs activité FV (figure 2A) et sont donnés en unités / ml. Les vitesses initiales (taux initial d'augmentation des A405nm sur les cinq premiers points dans le temps dans mUnits / min) et les extensions (maximum A405nm – Minimum A405nm) de formation de caillots dans le FV 1 – et le dosage de microplaques à 2 étages sont également indiquées.

Discussion

La méthode des microplaques cinétique d'essai décrit l'élaboration d'un roman, une technique rapide, peu coûteux et pratique pour la mesure de l'activité de coagulation FV dans des échantillons de plasma humain qui ne l'ont pas (FV 1-phase test) ou ont été intentionnellement activé par la thrombine ajoutée (FV 2 étapes d'analyse). Le test utilise un lecteur de microplaques cinétique et tous les matériaux et les réactifs nécessaires sont disponibles dans le commerce ou peuvent être réalisés en interne. L'essai contrôle en permanence la variation de la dispersion de la lumière de plasma au cours de la formation du caillot de fibrine à 405 nm. Le test microplaque a l'avantage d'utiliser de petits volumes d'échantillons plasmatiques (pl) et se prête à l'analyse de plusieurs échantillons en même temps (jusqu'à 12). Ces attributs d'analyse sont avantageux lorsque des équipements coûteux et réactifs sont utilisés (analyseurs automatisés et facteur déficientes plasmas), seuls petits volumes d'échantillon sont disponibles (plasmas de patients) ou l'analyse d'un grand nombre d'échantillons (f Pendant la purification FVrom plasma).

Le test FV microplaque a l'avantage supplémentaire qu'il est pratique, rapide, et ne nécessite pas l'isolement et la purification des éléments constitutifs nécessaires. En comparaison avec inclinaison manuelle du tube 3, 4 et 5-7 tests automatisés FV qui ont été signalés, le test FV microplaque a comparable gamme utile de fois caillot (25-75 sec) et les niveaux correspondants de FV dans l'échantillon (0,5 à 0.005 unités / ml), et la sensibilité / limites de détection (20-80pM). Par rapport aux analyses manuelles FV inclinaison du tube qui souffrent d'une évaluation visuelle subjective de formation de caillots 3, 4, le test FV microplaque permet de mesurer objective et quantitative du temps de coagulation, taux initial, et l'étendue de la formation du caillot de fibrine. En comparaison avec les tests automatisés FV qui souffrent de la condition des analyseurs et des réactifs coûteux 5-7, les réactifs de dosage FV microplaques et les matériaux sont peu coûteux et tout le matériel nécessaire peut être purchased commercialement ou faits maison. Inclinaison manuelle du tube 3, 4 et 5-7 dosages automatiques FV généralement seulement fournir le temps de formation du caillot; pas le temps, la fréquence initiale, et l'étendue de la formation du caillot de fibrine, qui sont tous exactement mesuré par spectrophotométrie avec le dosage FV microplaque. Enfin, manuel d'inclinaison du tube 3,4 et automatisé 5-7 dosages FV souffrent de ne pouvoir mesurer l'activité FV dans des échantillons de plasma un à la fois, tandis que le test FV microplaque se prête à haut débit et 12 échantillons peuvent être dosés simultanément.

Le test microplaque a été utilisée pour démontrer que la FV dans 9 plasmas de patients DIC a été moins active que dans les produits de santé naturels en raison d'une combinaison de temps caillot retardés et la baisse des taux initiaux de la formation de caillots dans le FV 1-étape de dosage. Les vitesses initiales de formation de caillots dans le FV 2-phase test dans les plasmas de patients DIC n'ont pas été modifiées de PSN. Les degrés de formation de caillots dans le patien DICt plasmas ont été également pas changé depuis les PSN dans le FV 1-2-étape et l'étape des essais. Diminution de la FV 1 étage, 2 étages, et l'activité totale peut être dû à une consommation accrue FV 19 et / ou de l'inactivation 6 conformément à d'autres études au cours de la pathogenèse de cette maladie du sang acquise. Compte tenu de l'étendue de la formation de caillots dans les plasmas DIC était la même que celle observée avec les produits de santé naturels, cette variable est très probablement le résultat de la concentration de fibrinogène dans le plasma déficient en FV et non liés aux caractéristiques des plasmas de patients.

Les résultats de l'essai indiqué que microplaque de mesure de l'activité FV dans des échantillons de plasma humain peut être obtenu à partir de la vitesse initiale et le temps de formation de caillot dans le FV-une étape de dosage et le temps de formation du caillot et l'activité totale de la FV 2 – test scène. Il n'a pas été possible d'obtenir une mesure quantitative de l'activité FV dans un échantillon de plasma en fonction du degré de formation de caillots dans til FV 1 – et 2-phase des essais ou de la vitesse initiale de formation de caillots dans le FV 2-phase test. Compte tenu de toutes les réactions atteint à peu près la même mesure de la formation de caillots de 0,35 à 0,45 unités entre l'absorbance initiale avant et après l'absorbance maximale thromboplastine et plus de chlorure de calcium, la mesure de l'ampleur de la formation de caillots ne fournit pas une évaluation quantitative de l'activité FV dans un proposée échantillon de plasma.

Le test microplaque roman trouveront une utilisation dans la recherche et les milieux cliniques pour la mesure de l'activité FV dans des échantillons de plasma humain et les fractions lors de sa purification à partir du plasma humain et animal. Le dosage microplaque peut être utilisé pour mesurer le temps, la fréquence initiale, et l'étendue de la formation de caillot; paramètres ne sont généralement pas surveillés simultanément en mode d'inclinaison du tube et des dosages de coagulation automatisés. Cette information fournit plus d'une évaluation quantitative complète de l'implication des FV lors de l'événement formation de caillotsdans le plasma humain que ce qui a été précédemment rapporté 3-7. Cette information est particulièrement importante dans la recherche et les laboratoires cliniques lors de la mesure des changements significatifs dans l'activité FV dans des échantillons de plasma ou purifiée FV ou FVa. Le test FV microplaque peut également être utilisé pour caractériser et mesurer les composés qui peuvent activer ou inactiver FV et FVa, mesurer l'activité FV chez les patients à risque de thrombose veineuse à la suite de la mutation FV Leiden 20, 21 et de surveiller l'activité de FV lors de sa purification à partir du plasma.

Le test FV microplaque est facilement adaptable pour mesurer l'activité d'un facteur de coagulation dans le extrinsèque, voie intrinsèque ou commune utilisant le facteur approprié du plasma déficient et d'initier des réactifs pour la formation de fibrine. Le test permettra de mieux comprendre la biochimie de la VF par une mesure plus précise et plus complète de son activité dans la recherche et les laboratoires cliniques. Ultimement, cette information aura un impact positif environnements de soins de santé grâce à un diagnostic plus précoce et au développement de traitements plus efficaces pour les personnes atteintes de troubles de la coagulation, tels que DIC.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche a été financée avec des fonds de perfectionnement professionnel et de recherche de démarrage de l'Université de l'Ontario Institute of Technology (UOIT) au Dr John A. Samis et les Instituts de recherche en santé Santé bourse professionnelle de recherche pour étudiants à Irina Levit. Les auteurs tiennent à remercier Shannon Everett (centre d'enseignement et d'apprentissage, UOIT) pour son aide pour préparer la vidéo. Les auteurs remercient le Dr Michael E. Nesheim (Département de biochimie, Université Queen, Kingston, ON) pour son mentorat, la perspicacité, et des discussions utiles. Les auteurs remercient également le Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hémostase et Thrombose Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, Royaume-Uni) pour fournir les plasmas de patients DIC utilisés dans l'étude.

Materials

Name of reagent Company Catalogue number Comments (Optional)
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.
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References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

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Factor V ActivityHuman PlasmaMicroplate Coagulation AssayBlood CoagulationThrombinFibrinogenClot FormationProthrombinaseFV AssaysAutomated FV AssaysMicroplate PlatformEnzyme-catalyzed EventsClot LysisPlatelet AggregationCoagulation FactorsFV Activity MeasurementKinetic Microplate ReaderAbsorbance Change At 405nm

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Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).
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