マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

1。 FV-欠乏ヒト血漿の調製この方法は、もともとブルームら 4で説明した手順を変更したものです。 任意の薬を服用されていない – 同意健常成人ボランティア（50歳男性または女性、18歳）から、ヒト全血を入手してください。作業中はゴム手袋と白衣を着用してください。 3.2％（w / v）の蒸留水にクエン​​酸三ナトリウム100mlを準備します。独立した60mlのシリンジに、この溶液の6.0ミリリットルをロードします。シリンジに6.0ミリリットルマークに慎重に気のめいるプランジャによって空気を除去する。 上腕と前腕の間に肘静脈の領域を洗浄する際には、アルコールを含ませた綿棒を使用しています。 3ミリリットルのシリンジに20ゲージの蝶装置を接続します。肘静脈に翼状針を挿入し、血液は3ミリリットルマークにいっぱいになるまでプランジャーを軽く引く。血液と注射器を廃棄します。このステップは、針で損傷した内皮細胞から放出された任意組織因子を除去するために行われる凝固プロセスをアクティブにするとFV欠乏血漿の準備を妨げる可能性があり、損傷部位。 6.0ミリリットルのクエン酸三ナトリウムと 'にすると、ロードされ' 60mlのシリンジに翼状針を接続し、血液がシリンジに60mlのマークに達するまでプランジャを軽く引く。 （最終クエン酸塩濃度10.9mM）。 翼状針からシリンジを取り外し、注射器をコンセントに手袋をはめた指または親指を保ちながら、穏やかに注射器を混ぜる。 前述のように3.2パーセントクエン酸三ナトリウム6.0ミリリットルでそれぞれが満たされた60mlのシリンジに採血を続行します。一つは、遠心分離後とFV欠乏血漿50μlをマイクロプレートアッセイのサンプルあたりの必要とされるプラズマとしてクエン酸血液量の約50％の回収率を予期すべきである。当研究室では、日常的に3.2パーセントクエン酸三ナトリウム/シリンジの6.0ミリリットルと5月7日×60 mlの注射器を使用して、各時点でクエン酸血の300〜420ミリリットルを処理します。これは、約3000マイクロのための十分なFV欠乏血漿であるプレートアッセイ（下記参照）。 ボランティアの腕から翼状針を外して、1.0分間静脈穿刺部位にわたって滅菌ガーゼパッドを押します。滅菌包帯で静脈穿刺部位をカバーしています。 室温で20分間3300 xgでクエン酸血を遠心分離します。下段赤と白の血液細胞層を乱さないように注意しながらプラスチックピペットを用いて攪拌棒を備えたプラスチック製ビーカーに、上部黄色のプラズマ層を回復します。 メジャーミリリットルのプラズマの体積および将来プロトロンビン凝固時間（PT）試験（下記参照）のために氷の上でのEDTAを添加する前に血漿100μlを保持します。 ゆっくり5mMの達成するために、室温で穏やかに攪拌しながらクエン酸血漿に固体のEDTAを加える（最終濃度）。 EDTAが溶解した後、穏やかに撹拌しながら1.0MのNaOHを滴下してpHを7.0に調整。 サランラップ、そして37℃で攪拌せずに8から10時間インキュベート℃でビーカーをカバー毎週2時間、100μlを回復するEDTA処理氷上プラズマとEDTAとのインキュベーション時のPTを決定し、事前のEDTAを添加（上記参照）に血漿のPTと比較します。 取り外し可能な場所8ウェルイムノストリップマイクロプレートリーダーにプラスチック製のテンプレートホルダとインサートの中には、PTの決定。 空、空、サンプル、空、空、サンプル、空、サンプル含有ストリップを隣国からの散乱光の干渉を最小限にするためにテンプレートホルダ内の左から右への空：としてマイクロプレートリーダーでオリエントイムノストリップ。また、プラスチック製のテンプレートホルダの端から散乱光の干渉を最小化するために各8ウェルイムノストリップに上から下へだけ井戸2-7を使用しています。 FVマイクロプレートアッセイを同時に少なくとも12の異なるサンプル（2イムノストリップ上のイムノストリップあたり6サンプル）中のフィブリンクロット形成を測定することが可能である。 にHBSの50μL（20mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4）を追加して、マルチチャンネルピペットを用いてよくアッセイするサンプルのそれぞれについて、各マイクロプレート。単一のピペットを使用して、マイクロプレートのウェルを分離するためにEDTAを添加した後にEDTAを添加する前に、または様々なインキュベーション時間で正常ヒトプール参照血漿（NHP）または血漿50μlを加える。 マルチチャンネルピペットを使用して、アッセイするプラズマですべてのマイクロプレートのウェルに50μlのトロンボプラスチン（調製方法については、以下を参照）を追加します。 1分、1分間のインキュベーションの15〜25秒の間に板を横に振るためのプログラム、マイクロプレートリーダーのために25℃でマイクロプレートリーダーでインキュベートする。 マイクロプレートリーダー、アクセスSoftMax Proソフトウェアマイクロアプリケーションを使用して連結されたコンピュータを使用した。吸光度を、405nmの波長に、キネティック、温度にモード25℃、プログラム、マイクロプレートリーダーを5秒間振り混ぜ、6分間毎に5秒405nmで吸光度を読み取る。にリーダーを設定する 2.1mmのFINA、マルチチャンネルピペットを使用して、（蒸留水で50μlの25mMの塩化カルシウムを追加lの濃度）はマイクロプレートウェルのすべてに、15秒待ってから、検定を開始するマイクロSoftMax社のProメニューの "スタート"アイコンを押します。 405nmでの吸光度の最大半減増加に達するまでの時間としてSoftMax社Proの吸光度対時間プロファイルからPTを決定します（トロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後生産シグモイド吸光度対時間曲線の中間点。下記を参照してください、 図1）。 図2Aに下図のようにログの餅時間（秒）とログのFV活性（単位/ ml）から、FV 1段活性を算出。定量の目的のために、FV活動の装着時は、前に追加され、トロンビン（FV 1段と2段のマイクロ凝固アッセイでヒト血漿サンプルをアッセイ、下記を参照してください）​​との意図的な活性化に1.0ミリリットルNHPでアクティビティプレゼントとして定義されています。 穏やかに撹拌しながら蒸留水に0.15MのNaClを含む20mMのHEPESの4.0リットルを用意します。遅いdropwでpHを7.4に調整し5.0M NaOHのISE加算（HBS、pH 7.4）で。 透析チューブの十分な長さを取得し、蒸留水で十分に洗い流してください。チューブの一方の端に結び目を作る。転送EDTAは、プラスチック製のピペットで透析チューブにプラズマを処理された空気を除去し、チューブのもう一方の端に結び目を結ぶ。 丁寧に穏やかに攪拌しながら、HBSにチューブ内のEDTA処理血漿をハング。サランラップで覆い、4℃で穏やかに攪拌しながら14-16時間透析慎重に15.0ミリリットルスクリューキャップチューブに3.0ミリリットルのアリコートにEDTA-treated/dialyzed血漿を除去し、氷の上で '最終' FV欠乏血漿のPTアッセイのための100μlを保持します。 -80℃で使用するまでに、FV欠乏血漿を格納します。上記の条件下で、EDTAの添加後90から100秒8から10時間へのEDTAを添加する前に10から15秒からのPTの増加となりました。この方法によって調製されたFV欠乏血漿は、日常的に開始に積極的にFV現在の0.1％未満を含んでいる新鮮なヒト血漿。 2。トロンボプラスチンの調製透析は、血液凝固プロセスを開始するために塩化カルシウム添加時から正確にタイミングフィブリン血栓形成を可能にするために、この試薬から任意のカルシウムを除去する必要がある。 穏やかに撹拌しながら、プラスチック製ビーカーに蒸留水で100mlと4.0リットル20mMのHEPESおよび0.15M NaClを準備します。 5.0MのNaOH（HBS、pH 7.4）でのゆっくり滴下してpHを7.4に調整してください。 トロンボプラスチン試薬の各バイアルにHBSは、pH7.4の6.0ミリリットルを加え、蓋を交換し、溶解するまで静かに横に振る。乾燥した材料を溶解させるために、室温で15分間かぶったバイアルに試薬をインキュベートする。完全に溶解するまで静かに横に振る。 、透析チューブの十分な長さをカットし、蒸留水でよくすすぎ、結び目とチューブの一方の端をオフに接続します。透析チューブにトロンボプラスチンを移し、空気を除​​去し、結び目とチューブのもう一方の端をオフに接続します。 のCarefully HBSは、pH7.4の4.0リットルの透析チューブをハング、優しく14から16時間、4℃でサランラップで覆っかき混ぜる。 使用するまで-80°Cで15 mlのスクリューキャップチューブ、ストアに透析したトロンボプラスチン3.0mlのアリコートを転送します。 3。 FV 1段マイクロ凝固アッセイアクティビティ標準曲線の作製 10分間37℃で、FV欠乏血漿、NHP、およびトロンボプラスチンを解凍します。穏やかに、独立して、FV欠乏血漿及びトロンボプラスチンを混ぜるプラスチック洗濯トレイを分離するために転送し、氷上でインキュベートする。穏やかに混合した後、氷上でNHPを保管してください。室温で独立した洗浄トレイにストア塩化カルシウム（蒸留水で25mm）で。 1.5を使用して、HBS（pH7.4）中で、512倍 – – 、2 – 、4 – 、8 – 、16 – 、32 – 、64 – 、128 – 、256、200μlの0からNHPの2倍連続希釈のそれぞれの準備mlのマイクロチューブ。よくボルテックスし、氷上でインキュベートする。 pに取り外し可能な8ウェルイムノストリップを置きマイクロプレートリーダーにラスチックテンプレートホルダとインサート。 空、空、サンプル、空、空、サンプル、空、サンプル含有ストリップを隣国からの散乱光の干渉を最小限にするためにテンプレートホルダ内の左から右への空：としてマイクロプレートリーダーでオリエントイムノストリップ。また、プラスチック製のテンプレートホルダの端から散乱光の干渉を最小化するために各8ウェルイムノストリップに上から下へだけ井戸2-7を使用しています。 FVマイクロプレートアッセイを同時に少なくとも12の異なるサンプル（2イムノストリップ上のイムノストリップあたり6サンプル）中のフィブリンクロット形成を測定することが可能である。 マイクロプレートリーダーおよびアクセスSoftMax社のProマイクロプレートアプリケーション·ソフトウェアをオンにします。 マルチチャンネルピペットを使用して、すべてのサンプルをマイクロプレートのウェルに、FV欠乏血漿（50μL）の同時追加を行う。単一のピペットを使用して、マイクロプレートのウェルを分離するために上記のように調製したNHPの10段階希釈液の50μlを添加する。マルチチャンネルピペットを使用すると、すべてのサンプルウェルにトロンボプラスチン（50μl）を追加します。 1分間のインキュベーションの15〜25秒の間に板を振って1分とプログラム、マイクロプレートリーダーのために25℃でマイクロプレートリーダー°Cでインキュベートする。 マイクロプレートリーダー、アクセスSoftMax Proソフトウェアマイクロアプリケーションを使用して連結されたコンピュータを使用した。波長405nm、その後6分間キネティック、25〜温度で405nmのC、およびプログラムマイクロプレートリーダー塩化カルシウムを添加した後の最初の5秒間振る、メジャー吸光度ごとに5秒のモードに波長、吸光度にリーダーを設定します。間隔を振って5秒は（下記参照）を算出クロット時間には含まれません。 塩化カルシウム（蒸留水で25mmの50μlを、最終濃度が3.5ミリメートル）を追加し、マルチチャンネルピペットを用いて15秒待ってから、すべてのサンプルをマイクロプレートのウェルに、開始するには、コンピュータからSoftMax社Proのマイクロアプリケーション内の "スタート"アイコンを押してくださいアッセイ。 T彼凝固時間は、トロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後405nmで最小と最大の吸光度との間の中間点に到達するまでの時間（秒）として計算されます。 血栓形成の初期速度を吸光度対時間曲線の直線部分に血栓形成の最初の5つの時点を包含する405nmの吸光度の増加率（mUnits /分）として計算されます。 血栓形成の程度は、血栓形成事象の間に達成さ405nmの（単位）で最大と最小の吸光度の差として算出した。 4。 FV 1段と2段のマイクロ波凝固アッセイでヒト血漿サンプルをアッセイ 10分間37℃で、FV欠乏血漿、NHP、サンプルプラズマ、及びトロンボプラスチンを解凍します。穏やかに、独立して、FV欠乏血漿及びトロンボプラスチンを混ぜるプラスチックのELISA洗浄トレーを分離するために転送し、氷上でインキュベートする。氷上NHPとサンプルプラズマを保存穏やかに混合した後。室温で別のELISA洗浄トレイ内のストア塩化カルシウム（蒸留水で25mm）で。 200μlを1.5 mlのマイクロチューブを使用して、HBS、pH7.4中NHPとサンプルプラズマの40倍希釈液のそれぞれを準備します。よくボルテックスし、氷上でインキュベートする。 プラスチック製のテンプレートホルダーに着脱可能な8ウェルイムノストリップを挿入し、マイクロプレートリーダーに挿入します。 サンプル含有ストリップを隣国からの散乱光の干渉を最小限にするためにテンプレートホルダ内の左から右への代替、空の空、サンプル、空、空、サンプル、空、空のイムノストリップ。プラスチック製のテンプレートホルダの端から光散乱干渉を最小限に抑えるため、各イムノストリップに上から下へだけ井戸2-7を使用してください。 マイクロプレートリーダーおよびアクセスSoftMax社のProマイクロプレートアプリケーション·ソフトウェアをオンにします。 マルチチャンネルピペットを使用して、すべてのサンプルをマイクロプレートのウェルに、FV欠乏血漿（50μl）を追加します。 SINGLを使用して電子ピペットは、マイクロプレートウェルを分離するために上記のように調製した40倍希釈したNHPまたはサンプルプラズマの50μlを添加する。 マルチチャンネルピペットを使用すると、すべてのサンプルウェルにトロンボプラスチン（50μl）を追加します。 1分間のインキュベーションの15〜25秒の間に板を振って1分とプログラム、マイクロプレートリーダーのために25℃でマイクロプレートリーダー°Cでインキュベートする。 マイクロプレートリーダー、アクセスSoftMax Proソフトウェアマイクロアプリケーションを使用して連結されたコンピュータを使用した。波長405nm、その後6分間キネティック、25〜温度で405nmのC、およびプログラムマイクロプレートリーダー塩化カルシウムを添加した後の最初の5秒間振る、メジャー吸光度ごとに5秒のモードに波長、吸光度にリーダーを設定します。間隔を振って5秒は（下記参照）を算出クロット時間には含まれません。 すべてのサンプルマイクロプレートのウェルに、すぐにPR、マルチチャンネルピペットを用いて、塩化カルシウム（終濃度6.25mM蒸留水に25mmの50μl）を追加アッセイを開始するには、コンピュータからSoftMax社Proのマイクロアプリケーションの[スタート]アイコンをESS。 実行の終了時に、時間、初期速度、及びSoftMax社Proで吸光度対時間プロファイルから40倍に希釈したNHPとサンプルプラズマの血栓形成の程度を決定する。 アカウントに40倍希釈を考慮して、ログ餅時間とログのFV活動のFV 1ステージ活動標準曲線（ 図2A）から単位/ mlでのFV活性を算出し、各試料について凝固時間を使用しています。これは、トロンビンによる "意図的な"活性化の有無に関わらず、FV-1ステージの活動やそれを表しています。 FVは、アクティブな補因子にトロンビンにより活性化されているので、FVA 1、トロンビンとの加算とインキュベーションした後第二のアッセイは、正確に血漿試料のFV 2段活性（追加トロンビンによる"意図的な"アクティベーション付き）測定することが重要です。 FV 2段階アッセイのために、トロンビン18精製の​​200から300μlを準備HBS中トン100nMの、pH7.4及び氷上でインキュベートする。 FV 2段検定で検定する各血漿試料、希釈トロンビン10μlを使用する予定です。 2.8mmの塩化カルシウムを含むHBS、pH7.4の170μlの100倍〜40倍から上記NHPとサンプルプラズマの120μlを希釈します。各サンプルに10μlのトロンビン（10nMで最終濃度）を追加します。ボルテックスよく1分間37℃で混合し、インキュベートする。 上記のように1段マイクロプレートアッセイFV内の各血漿試料50μlを、HBS、pH7.4の400μlを添加し、ボルテックスウェル、アッセイにより500倍にNHPとサンプルプラズマを希釈します。 NHPとSoftMax社Proで吸光度対時間プロファイルから測定し、各血漿試料のための凝固時間を決定します。アカウントに500倍希釈を考慮して、ログの餅時間とログのFV活動のFV 1段標準曲線（ 図2A）からFV 2段活性を算出し、各サンプルのため凝固時間を使用しています。 合計FV活動FV 1段活動 – TYは、その後、FV 2段の活性と​​して算出してもよい。