Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest

1. Bereiding van FV-deficiënte Human Plasma Deze methode is een modificatie van de werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Bloom et al. 4. Zorg voor volledig menselijk bloed uit een toestemmende gezonde volwassen vrijwilligers (man of vrouw, leeftijd 18 – 50 jaar) die niet is het nemen van medicatie. Draag latex handschoenen en een labjas gedurende de gehele procedure. Bereid 100 ml van 3,2% (w / v) trinatriumcitraat in gedestilleerd water. Plaats 6,0 ml van deze oplossing in afzonderlijke 60 ml spuiten. Verwijder lucht door het indrukken van de plunjer voorzichtig naar de 6,0 ml markering op de spuit. Gebruik een alcoholdoekje om het gebied van de cubitaal ader tussen biceps en onderarm schoon te maken. Sluit 20 gauge vlinder inrichting voor een 3 ml spuit. Steek vlinder naald in cubitaal ader en trek voorzichtig aan zuiger tot bloed worden gevuld met de 3 ml streepje. Gooi spuit met bloed. Deze stap wordt uitgevoerd om een ​​tissue factor model van het beschadigde endothelium aan de naald te verwijderenletsel site die het stollingsproces kan activeren en interfereren met de voorbereiding van FV-deficiënt plasma. Sluit vlindernaald tot 60 ml spuit 'geladen' met 6,0 ml trinatriumcitraat en teken voorzichtig op de zuiger tot het bloed bereikt de 60 ml markering op de spuit. (Final citraatconcentratie 10.9mm). Verwijder de spuit uit vlindernaald en meng spuit terwijl een gehandschoende vinger of duim op de spuit stopcontact. Blijven er bloed in 60 ml spuiten elk gevuld met 6,0 ml 3,2% trinatriumcitraat zoals hierboven beschreven. Men moet anticiperen terugwinning van ongeveer 50% van de citraatbloed volume plasma na centrifugeren en 50 ul FV-deficiënt plasma nodig per monster in de microplaat assay. Ons laboratorium routinematig verwerkt 300-420 ml citraatbloed tegelijk met 5-7 x 60 ml spuitjes met elk 6,0 ml 3,2% trinatriumcitraat / spuit. Dit is voldoende FV-deficiënt plasma ongeveer 3000 microplaatanalyses (Zie hieronder). Verwijder de vlinder naald uit de arm vrijwilliger en druk op een steriel gaasje over site van de ader prikken voor 1,0 minuten. Cover site van ader punctie met een steriel verband. Centrifugeer bij 3300 citraatbloed xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Recover bovenste gele plasma laag om een ​​plastic beker met een roerstaaf met behulp van een plastic transferpipet zorg ervoor dat u de onderste rode en witte bloedcellen laag verstoren. Meet het volume van het plasma in ml en behouden 100 ul van plasma voor EDTA aanvulling op ijs voor toekomstige protrombinetijd stolsel tijd (PT) testen (zie hieronder). Voeg langzaam vaste EDTA aan gecitreerd plasma met voorzichtig roeren bij kamertemperatuur 5 mM bereiken (eindconcentratie). Zodra de EDTA is opgelost, de pH op 7,0 door druppelsgewijze toevoeging van 1,0 M NaOH met voorzichtig roeren. Dek bekerglas met Saran Wrap en incubeer gedurende 8-10 uur zonder roeren bij 37 ° C. Elke 2 uur, herstellen 100 ulde EDTA-plasma behandeld op ijs en bepalen de PT bij de incubatie met EDTA en vergelijken met de PT van plasma vóór toevoeging EDTA (zie hierboven). Voor de PT bepalingen, plaats verwijderbare 8 goed immunomodule strips in plastic mal houder en steek deze in microplaatlezer. Orient immunomodule strips in microplaatlezer als: leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Ook alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk 8 goed immunomodule strip aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder. De FV microplaat assay kan meten fibrine stolselvorming in ten minste 12 verschillende monsters tegelijkertijd (6 samples per immunomodule strip over 2 immunomodule strips). Met een meerkanaalspipet, voeg 50 ul HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) totelke microplate goed voor elk monster worden getest. Met een pipet 50 pl normaal menselijk plasma samengevoegd referentie (NHP) of plasma voor toevoeging van EDTA of verschillende incubatietijden na toevoeging van EDTA tot microplate putjes scheiden. Met behulp van een multi-channel pipet, voeg 50 ul tromboplastine (Zie hieronder voor bereidingswijze) om alle microplaat putten met een plasma te worden getest. Incubeer in microplaat reader bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie. Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma te schudden gedurende 5 seconden, en de absorptie afgelezen bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten. Met een meerkanaalspipet, voeg calciumchloride (50 pi 25 mM in gedestilleerd water; 2.1mm final concentratie) om alle van de microplaat putten, wacht 15 sec, en druk op de 'Start' icoon op de microplaat SoftMax Pro menu om de test te beginnen. Bepaal de PT van de absorptie vs Time profielen SoftMax Pro de tijd om de helft van de maximale toename in absorptie bij 405 nm (het middelpunt van de sigmoïdale absorptie versus tijd curve geproduceerd na tromboplastine en calciumchloride toevoeging. Zie bereiken, figuur 1). Bereken de FV 1-traps activiteit van de Log Clot Time (sec) tegen log FV Activiteit (eenheden / ml), zoals hieronder geïllustreerd in figuur 2A. Voor kwantificatie doeleinden wordt 1unit van FV activiteit gedefinieerd als de activiteit die aanwezig is in 1.0 ml NHP voor opzettelijke activering van trombine toegevoegd (zie hieronder, Analyseren humaan plasma met FV 1-fase en twee-fase coagulatietest microplaat). Bereid 4.0L 20 mM HEPES met 0,15 M NaCl in gedestilleerd water onder voorzichtig roeren. Breng de pH op 7,4 met langzame dropwise toevoeging van 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4). Zorg voor een voldoende lengte van de dialyse buizen en goed naspoelen met gedestilleerd water. Bind een knoop in het ene uiteinde van de slang. Transfer EDTA behandelde plasma dialyse buis met een plastic overdracht pipet, verwijder de lucht, en leg een knoop in het andere uiteinde van de slang. Voorzichtig hang de EDTA-behandelde plasma in de slang in de HBS met voorzichtig roeren. Bedek met Saran Wrap en dialyseer voor 14-16u onder zachtjes roeren bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig de EDTA-treated/dialyzed plasma in 3,0 ml porties tot 15,0 ml schroef bedekte buizen en behouden 100 ul voor PT-test van 'final' FV-deficiënt plasma op ijs. Sla de FV-deficiënt plasma in bij -80 ° C tot gebruik. Onder de aangegeven omstandigheden de PTS stijging van 10-15 sec voordat EDTA aanvulling tot 90-100 sec 8-10 uur na toevoeging EDTA. De FV-deficiënt plasma bereid door deze methode bevat gewoonlijk minder dan 0,1% van de actieve FV in de startvers menselijk plasma. 2. Bereiding van Thromboplastin Dialyse is nodig om elke calcium uit het reagens om precies timing fibrine stolselvorming het tijdstip van calciumchloride Naast coagulatie gang kan. Bereid 100 ml en 20 mM HEPES 4.0L en 0,15 M NaCl in gedestilleerd water in een kunststof beker met voorzichtig roeren. Breng de pH op 7,4 met langzame druppelsgewijze toevoeging van 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4). Voeg 6,0 ml van HBS, pH 7,4 aan elk flesje van tromboplastinereagens, vervang het deksel, en schud voorzichtig om op te lossen. Incubeer reagens in capped buisjes gedurende 15 min bij kamertemperatuur gedroogd materiaal op te lossen. Schud zachtjes om volledig op te lossen. Snijd een voldoende lengte van de dialyse slangen, goed spoelen met gedestilleerd water, en af ​​te hechten het ene uiteinde van de slang met een knoop. Overdracht tromboplastine aan dialysebuis, verwijder de lucht, en af ​​te hechten andere uiteinde van de slang met een knoop. Carefully hangen dialyseslang in 4.0L van HBS, pH 7,4 en voorzichtig bedekt met Saran Wrap roeren bij 4 ° C 14-16 uur. Breng 3,0 ml van het gedialyseerde tromboplastine tot 15 ml schroef afgesloten buizen en bij -80 ° C tot gebruik. 3. Voorbereiding van FV 1-traps Microplate coagulatietest Activiteit Standard Curves Ontdooien FV-deficiënt plasma, NHP, en tromboplastine bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voorzichtig los te mengen FV-deficiënt plasma en tromboplastine, over te dragen aan plastic wassen trays te scheiden, en incubeer op ijs. Bewaar de NHP op het ijs na voorzichtig mengen. Store calciumchloride (25 mM in gedestilleerd water) in een aparte bak wassen bij kamertemperatuur. Bereid 200 ui elk 2-voudige seriële verdunningen van NHP van 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-voudig in HBS, pH 7,4 met 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Vortex putje en incubeer op ijs. Plaats verwijderbare 8 goed immunomodule strips in pLastic template houder en steek deze in microplaatlezer. Orient immunomodule strips in microplaatlezer als: leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Ook alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk 8 goed immunomodule strip aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder. De FV microplaat assay kan meten fibrine stolselvorming in ten minste 12 verschillende monsters tegelijkertijd (6 samples per immunomodule strip over 2 immunomodule strips). Zet microplaatlezer en toegang SoftMax Pro microplate toepassingssoftware. Met een meerkanaalspipet maken gelijktijdige toevoeging van FV-deficiënt plasma (50 pl) alle wells microplate monster. Gebruik een pipet 50 ul van de 10 seriële verdunningen van NHP hierboven wells microplate bereid scheiden. Met een meerkanaalspipet, voeg tromboplastine (50 pl) alle monsterholten. Incubeer in de microplaatlezer bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie. Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma voor de eerste 5 sec schudden na toevoeging calciumchloride en meet de absorptie bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten daarna. De 5 sec schudden interval wordt niet opgenomen in de berekende stolsel tijden (zie hieronder). Met behulp van een multi-channel pipet, calciumchloride (50 ul van 25 mM in gedestilleerd water; eindconcentratie 3,5 mm) toe te voegen aan alle monster microplaat putten, wacht 15 sec, drukt u op de 'Start' icoon in de microplaat toepassing in SoftMax Pro van de computer naar het begin assay. Thij stolsel tijden worden berekend als de tijd in seconden tot aan het midden tussen de minimale en maximale absorptie te bereiken bij 405 nm na tromboplastine en calciumchloride toevoeging. De beginsnelheid van stolselvorming worden berekend als het percentage toename in absorptie bij 405 nm (mUnits / min) dat de eerste 5 tijdstippen van stolselvorming omvatten in het lineaire deel van de absorptie tegen de tijd curve. De mate van stolselvorming werd berekend als het verschil tussen de maximale en minimale absorptie bij 405 nm (Eenheden) bereikt tijdens de stolselvorming event. 4. Analyseren humaan plasma met de FV 1-traps en 2-traps Microplate coagulatietest Ontdooien FV-deficiënt plasma, NHP, plasma monster, en tromboplastine bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voorzichtig los te mengen FV-deficiënt plasma en tromboplastine, over te dragen aan kunststof ELISA wassen trays te scheiden, en incubeer op ijs. Bewaar de NHP en proef plasma op ijsNa voorzichtig mengen. Store calciumchloride (25 mM in gedestilleerd water) in een afzonderlijke ELISA wassen tray bij kamertemperatuur. Bereid 200 ui elk van 40-voudige verdunningen van NHP en plasma monster in HBS, pH 7,4 met 1,5 ml microcentrifugebuizen. Vortex putje en incubeer op ijs. Plaats het verwisselbare 8 goed immunomodule strips in plastic mal houder en in te voegen in microplaatlezer. Alternatieve leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege immunomodule strips van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Gebruik alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk immunomodule strook aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder. Zet microplaatlezer en toegang SoftMax Pro microplate toepassingssoftware. Met een meerkanaalspipet, voeg FV-deficiënt plasma (50 pl) alle wells microplate monster. Met een single pipet, voeg 50 ul van 40-voudig verdunde NHP of monster plasma's boven bereid om microplate putten te scheiden. Met een meerkanaalspipet, voeg tromboplastine (50 pl) alle monsterholten. Incubeer in de microplaatlezer bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie. Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma voor de eerste 5 sec schudden na toevoeging calciumchloride en meet de absorptie bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten daarna. De 5 sec schudden interval wordt niet opgenomen in de berekende stolsel tijden (zie hieronder). Met een meerkanaalspipet, voeg calciumchloride (50 pi 25 mM in gedestilleerd water; eindconcentratie 6,25 mm) om alle wells microplate monster onmiddellijk press de 'Start' icoon in de microplaat toepassing in SoftMax Pro van de computer naar de test te beginnen. Aan het einde van de run, de tijd bepalen, initiële snelheid en omvang van stolselvorming voor 40-voudig verdunde monster NHP en plasma van de absorptie vs tijdprofielen in SoftMax Pro. Rekening houdend met de 40-voudige verdunning, met de stollingstijd voor elk monster de FV activiteit te berekenen in eenheden / ml van de 1-traps FV activiteit standaardcurve van Log stollingstijd tegen log FV activiteit (Figuur 2A). Dit komt overeen met de FV-1 fase activiteiten of die zonder 'opzettelijke' activering door trombine. Aangezien FV geactiveerd met trombine de actieve cofactor, FVa 1, een tweede analyse na toevoeging en incubatie met trombine is cruciaal voor nauwkeurige meting van het FV 2-traps activiteit van een plasmamonster (met 'intentionele' activering door trombine toegevoegd). Voor de FV 2-fase test, bereiden 200-300 pi gezuiverd trombine 18 at 100 nM in HBS, pH 7,4 en geïncubeerd op ijs. Plan 10 pl verdund trombine gebruiken voor elke plasma monster wordt bepaald met de FV twee-fase test. Verdun 120 pl van de bovenstaande NHP en plasma monster van 40-voudig tot 100 maal met 170 ul HBS, pH 7,4 die 2,8 mm calciumchloride. Voeg 10 ul trombine (10 nM eindconcentratie) aan elk monster. Vortex goed te mengen en bij 37 ° C geïncubeerd gedurende 1 min. Verdun NHP en plasma monster tot 500-voudig door het toevoegen van 400 ul HBS, pH 7,4, vortex goed en assay 50 pi van elk plasmamonster in de FV 1-traps microplaat test zoals hierboven beschreven. Bepaal het stolsel tijd voor NHP en elke plasma monster getest van de absorptie vs Time profielen in SoftMax Pro. Rekening houdend met de 500-voudige verdunning met de stollingstijd voor elk monster de FV 2-traps activiteit van het FV berekenen 1-traps standaardcurve van Log stollingstijd tegen log FV activiteit (Figuur 2A). De totale FV activiteitenty kan dan worden berekend als FV 2-traps activiteit – FV 1-traps activiteit.