A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso

A generalizada, intracelular obrigatório, o protozoário parasita Toxoplasma gondii causa a doença oportunista em pacientes imunocomprometidos e causa defeitos congênitos em infecção congênita. O ciclo de replicação lítica é caracterizada por três fases: 1. invasão activa de uma célula hospedeira nucleada; 2. replicação no interior da célula hospedeira; 3. egresso activo a partir da célula hospedeira. O mecanismo de saída é cada vez mais apreciada como um processo único e altamente regulado, o que ainda é pouco compreendida no nível molecular. As vias de sinalização de saída subjacentes foram caracterizados através da utilização de agentes farmacológicos que actuam em diferentes aspectos das vias ^1-5. Como tal, vários accionadores independentes de saída têm sido identificados, que convergem sobre a libertação de Ca ^{2 +} intracelular, um sinal que é também crítico para a invasão da célula hospedeira ^6-8. Esse insight informou uma abordagem de gene candidato, que levou à identificaçãoficação da planta como a proteína quinase dependente de cálcio (CDPK) envolvidos na saída ^9. Além disso, vários avanços recentes na saída compreensão foram feitas usando (químico) abordagens genéticas ^10-12. Para combinar a riqueza de informação farmacológica com o aumento da acessibilidade genética de Toxoplasma que recentemente estabeleceu uma tela que permite o enriquecimento de mutantes do parasita com um defeito na saída da célula hospedeira ^13. Embora mutagénese química, utilizando N-etil-N-nitrosoureia (ENU) ou etilo metanossulfonato (EMS) tem sido utilizada há décadas no estudo da biologia Toxoplasma ^11,14,15, só recentemente tem mapeamento genético de mutações subjacentes aos fenótipos se rotina ^{16 -18.} Além disso, através da geração de mutantes sensíveis à temperatura, os processos essenciais podem ser dissecado e os genes subjacentes directamente identificado. Estes mutantes comportam-se como de tipo selvagem sob a temperatura permissiva (35 ° C), mas não conseguem proliferate à temperatura restritiva (40 ° C), como um resultado da mutação em questão. Aqui temos ilustrar um método de rastreio novo fenotípica para isolar mutantes com um fenótipo sensível à temperatura de saída ^13. O desafio para as telas de ingresso é separar egressos dos não-egressos parasitas, o que é complicado pela rápida re-invasão e aderência geral dos parasitas nas células hospedeiras. Uma tela de saída foi anteriormente estabelecido com base numa série de passos complicados biotinilação para separar intracelular de parasitas extracelulares ^11. Este método também não gerar mutantes condicionais, resultando em fenótipos fracos. O método descrito aqui supera a forte ligação de egressing parasitas através da inclusão de um concorrente glicano, sulfato de dextrano (DS), que impede a aderência de parasitas da célula hospedeira ^19. Além disso, os parasitas extracelulares são especificamente morto por pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), o que deixa parasitas intracelularesileso ^20. Portanto, com uma nova tela fenotípica especificamente para isolar mutantes parasitas com defeitos na saída induzido, o poder da genética agora pode ser totalmente implantado para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à saída da célula hospedeira.