Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em> Drosophila</em> Syncytieel Embryo's

1. Transgene Vliegen en onderhoud De transgene vliegen die in deze demonstratie UBQ-GFP-Cdc20 (II), UBQ-RFP-His2B (X *) UBQ-GFP-Cdc20 (II *) UBQ-GFP-Cdc20 (II *) mad2 EY ( III *) en UBQ-GFP-Cdc20 transgene vliegen werden eerder gegenereerd in het laboratorium via een standaard-element P gemedieerde transgene benadering 10,11 en UBQ-RFP-His2B een vriendelijke schenking van Yohanns Belaïche op UMR 144 CNRS / Institute Curie, Parijs, Frankrijk. Ze werden in een Mad2 mutant achtergrond via een standaard Drosophila genetica. De mad2 EY originele mutant lijn werd gekocht van de Bloomington voorraad centrum. We zullen niet ingaan op de procedure die wordt gebruikt voor het verhogen van de transformanten in dit protocol. Opmerking: * vertegenwoordigt chromosomenaantal. Onderhoud: Transgene vliegen werden bij 25 ° C in kunststof flesjes containing vliegen eten en met extra droge gist poeder op de top. Het flesje werd routinematig vervangen 3-4 weken afhankelijk teeltomstandigheden (figuur 1). 2. Fly Voedselbereiding (Lab schaal) De juiste hoeveelheid van de vlieg voedsel mengsel werd verwarmd met constant voeren om de bestanddelen op te lossen. Ongeveer 8-10 ml van dit medium werd verspreid als mest in elke plastic flacon (2,5 cm diameter x 8 cm lengte) met behulp van een Jencons Scientific Ltd peristaltische pomp. Wanneer het voedsel slurry werd en afgekoeld tot kamertemperatuur wordt de flacon vervolgens aangesloten met een katoenen schuim plug. Deze voedingsmiddelen flesjes worden geplaatst in een bak die vervolgens wordt afgesloten in een plastic zak en bewaard bij 4 ° C voor later gebruik. 3. Kleinschalige Egg Collection Ongeveer 50 paren van 2-3 dagen oude volwassen vliegen werden overgebracht naar een nieuwe vlieg voedsel flacon voorzien extra droge gist poeder op het oppervlak bij 25 ° C layIng embryo's. De vliegen worden dan overgebracht naar een nieuwe flacon per uur en laten de embryo's flacon 30 minuten om een ​​aantal van de verzamelde embryo's van rond kerndeling cyclus 8-10 wanneer de kern geleidelijk migreren naar de schors en ingericht als een monolaag. Het eerste uur collectie is normaal gesproken weggegooid omdat het vaak bevat oude embryo's die werden vastgehouden in het vrouwelijke lichaam als de omstandigheden waren niet geschikt voor het leggen. 4. Voorbereiden Dekglaasjes en Dia's Neem een ​​50 x 22 mm dekglaasje en licht de vier hoeken aan de ene kant nat te maken met een zeer kleine hoeveelheid water met een vochtige fijne pen penseel en zet het op een microscoopglaasje, zodat het dekglaasje niet beweegt als gevolg van de capillaire oppervlaktespanning door de dunne vloeistof film. Breng een dunne strook van heptaan lijm over het midden van het dekglaasje, moet de heptaan verdampen in enkele seconden om de lijm te laten staan ​​dekglaasje aan. Snijd een andere dekglaasje met een diamant pen in kleine vierkantjes (~ 1,5 mm 2), pick-up een en plaats het op het ene uiteinde van de lijm strip (dit wordt gebruikt om de naald te openen wanneer micro-injectie is vereist) en bewaar de andere voor de toekomst gebruikt. Neem een ​​ander objectglaasje en plak een stukje dubbelzijdig plakband ongeveer 2 cm lang om het vast en trek het deksel van papier. (Zie figuur 2A en B). 5. Dechorionate Embryo's Breng de vliegen een verse voeding sluier en gebruik bevochtigde fijne pen borstel 50 eieren te brengen op de dubbelzijdige plakband op de slede met een geschikte hoeveelheid vloeistof om de eieren worden gespreid. Als de vloeistof verdampt is de eieren zal houden aan de tape. Onder een stereomicroscoop druk de eieren een paar keer langs hun lange as met behulp van de buitenkant van een helft van een pincet voorzichtig totdat het chorion is gebroken en open, maar laat de embryo in de Chorion-shell om snelle uitdroging te voorkomen. Verder dit proces tot 10-20 van de eieren is behandeld (afhankelijk van het aantal van de eieren nodig voor een experiment). De embryo kan dan worden opgevangen en uit het chorion schaal en zacht op de lijmstrook een voor een. De eieren kunnen worden geplaatst en hetzij afgestemd op de lange zijde van het embryo parallelle of anti-parallel aan de lange zijde van de lijmstrook afhankelijk als zij worden geinjecteerde. De embryo's kunnen direct bedekt met een geschikte hoeveelheid Voltalef 10S olie (5:1 mengsel van Holocarbon 700 olie en 27 olie, Sigma) verder uitdroging voorkomen dat onmiddellijk imaging of in een kamer voor uitdroogtolerantie 3-8 minuten op uitdrogen ze verder afhankelijk van de vochtigheid in de ruimte en het doel van het experiment. De gedroogde embryo's moeten worden gedekt met de 10S olie waar nodig tot over-uitdroging te voorkomen als micro-injectie nodig is. (Zie afbeelding. 2C, D& E). 6. Imaging Embryo's Time-lapse of enkele afbeeldingen van levende embryo's worden verzameld met behulp van een Leica TCS SP2 omgekeerde confocale microscopie-systeem met een HCX PL APO CS 40X 1.25 olie immersie objectief (60 of 100X doelstellingen kunnen worden gebruikt ook afhankelijk van het doel van het experiment, hoe hoger de vergroting gebruikte meer foto bleken optreedt). Wanneer imaging meerdere fluoroforen, die overlappende spectra en samen in dezelfde embryo werd elke fluorescent eiwit Golflengte elkaar verzameld. De excitatie en emissie golflengtes beschikbaar op de Leica TCS SP2 systeem zijn: GFP, λ Ex: 488 nm en λ Em: 500-600 nm. RFP, λ Ex: 543 nm en λ Em: 555-700 nm. Een enkel beeld is vaak verkregen als een gemiddelde van 2 scanlines met een gemiddelde van 2 frame-scans. Dit duurt minimaal 6,3 seconden te scannen een 512×512 pIxel beeld een gelijktijdige scanmodus en 15,44 seconden voor een sequentiële scanmodus en produceert een goede signaal-ruisverhouding. Deze tijden moeten worden gehouden bij het opzetten van de termijnen voor time-lapse beeld verzamelen. De pinhole is normaal ingesteld tot 1-2 AU (luchtige eenheid), en het laservermogen is aangepast aan de laagst mogelijke niveau tot een aanzienlijke fotobleken te voorkomen. 7. Uitlokken van de SAC door Microinjecting de Embryowet met de juiste reagentia Bereid de naald voor het experiment. Wij geven de voorkeur om de naald te trekken van gesiliconiseerde glazen capillairen (GC-100-10, Harvard) met behulp van de vlammende / bruin micropipet trekker (Sutter Instrument, Model: P-97) met parameters: warmte = 600, trek = 90, vel = 70 , del = 150. Plantgat de naald met 1-2 ml van een geschikte concentratie van het reagens in injectie buffer met een fijne laad-tip (20 pl Eppendorf veel: W215818J). Monteer de naald in de naald holder de microscoop met de persleiding verbonden met de Eppendorf injectie systeem. Zoek een embryo onder de 40x objectief en vind de naald schaduw zonder dat het brandvlak door het bewegen van de naald in het midden van het gezichtsveld en geleidelijk verlagen van het naar de juiste brandvlak worden geplaatst. Beweeg het embryo zachtjes de kleine kwadraat van de gebroken dekglaasje voorgemonteerd aan een uiteinde van de lijmstrook vinden. Heel voorzichtig beweeg de naald totdat hij raakt de rand van het kleine vierkante dekglaasje voorzichtig breekt open het. Beweeg de embryo's in beeld en selecteer het embryo van de juiste leeftijd voor injectie. Ik Gewoonlijk injecteert het embryo op kerndeling cyclus bij 5-7, omdat dit voor de kernen naar buiten te migreren naar de cortex. De kerndeling fasen kan worden bepaald door een snel aftasten van de fluorescerende signalen van het GFP-Cdc20 of nucleaire signaal van de RFP-histon 2B voorafgaand aan injectie 9. Verplaats voorzichtig de Embryo in de buurt van de naald en stel het brandvlak voor zowel het embryo en de naald. Verplaats de embryo in de naald en spuit een druppel van het reagens in de gewenste positie en af ​​te stappen van de embryo (of volg de instructies voor het micro-injectie-systeem). De embryo wordt geïnjecteerd de achterste of de zijkant afhankelijk van het doel van het experiment. Na injectie wordt het embryo klaar om te worden afgebeeld op het juiste moment. (Zie afbeelding 2F & G) 8. Representatieve resultaten Figuur 1. Benodigde materialen: een. fijne pen borstel, b. pleintje gebroken glazen container, c. 22 x 50 mm dekglaasje, d. microscoopglaasje, e. dubbelzijdige plakband, f. droge gist poeder in reageerbuis met gaten op de deksel, g. gistgranule voor vlieg onderhoud h. vliegen voedsel flacon, i. helft van een pincet voor dechorionate embryo's j. een paar pincet, k. heptaan lijm vloeistof container (maatkolf). Figuur 2. De diagrammen tonen de voorbereiding van de dekglaasjes en dia's in stap 4, embryo dechorionation in stap 5 en naald voorbereidingen voor micro-injectie in stap 7. A. De bovenste foto toont een dekglaasje met een strook heptaan lijm in het midden en een vierkant met gebroken dekglaasje vast aan een uiteinde. De onderste foto toont een microscoopglaasje met een dun laagje water op de vier hoeken een dekglaasje te houden. De reden voor het gebruik van een dia aan het dekglaasje te houden is om ongeveer dezelfde brandpuntsafstand als die gevonden te houden als je dubbelzijdig plakband op de dia's en dus het vermijden heroriëntatie van de microscoop terwijl je are ontleden en het overdragen van de embryo's tussen de band en dekglaasje aan. B. Een dia met een korte lengte van dubbelzijdig plakband aangebracht voordat de afpellen van de cover papier dat voor dechorionating het embryo. C. De foto links toont embryo's met intacte chorion schelpen met gemarkeerde voorste en achterste uiteinden, de foto rechts ziet u de embryo's in de gebroken schelpen chorion voordat ze werden overgebracht naar het dekglaasje met de lijm strip D & E Schema's tonen twee.. manieren voor het overbrengen, het plaatsen en uitlijnen van de dechorionated embryo's op lijmrillen. De embryo's werden gedekt door 10S olie na een passende uitdroging periode. F & G. Diagrams laten zien hoe je de punt van de naald en plaats hem zodanig te injecteren te openen. Enkele of timelapse beelden verkregen bij de hierboven beschreven experimenten direct geanalyseerd met Leica software of opgeslagen in. TIF bestanden open format beschikbaar voor verdere kwantificering of bewerken van analyses met behulp van andere veel voorkomende beeldanalyse-programma's zoals Image J, Photoshop en Metamorph enz. Twee voorbeelden om dit te illustreren worden hieronder besproken: Voorbeeld 1: Een time-lapse film (figuur 3) geeft de dynamische kinetochoor werving van GFP-Cdc20 en chromosoom beweging in het leven Drosophila syncytieel embryo's. De regio van de belangstelling van originele time-lapse sequence beelden was vastgesteld / gewijzigd en geautomatiseerde-batch omgezet met behulp van Photoshop-software. De film werd samengesteld met behulp van QuickTime-software. Figuur 3. Een time-lapse filmpje toont de dynamische kinetochoor werving van GFP-Cdc20 en chromosoom beweging in het leven Drosophila syncytieel embryo's. (A) Time-lapse foto's werden genomen van een transgene syncytieel embryo co-expressie GFP-Cdc20 (in groen)en RFP-histon 2B (in rood) fusie-eiwitten en werden opgenomen met een Leica TCS SP2 confocale systeem bij 18 ° C tijdens de kerndeling cycli 7-8. Frames werden genomen om de 10 seconden. Het frame met de cellen al in profase wordt behandeld als de nul tijdstip 10. Klik hier om de film te bekijken voor Figuur 3A . (B) GFP-Cdc20 gemakkelijk kan worden waargenomen op profase en prometafase kinetochoren (B3 & 4, witte pijlen) en blijft op de metafase en anafase kinetochoren (B5 & 6, witte pijlen). GFP-Cdc20 is uitgesloten van de interfase kern (White pijlpunt), het invoeren van de kern door vroege profase. Chromatine morfologie werden bepaald met behulp van co-expressie His2BmRFP als markers (B8-14). Bars = 5mm. Voorbeeld 2: SAC functies kunnen worden bestudeerd door het manipuleren van de embryo's door microinjecting antilichamen, fluorescent gelabelde eiwitten of Chemical verbindingen van belang dat mogelijk in de SAC te activeren. Bijvoorbeeld injecteren colchicine de microtubules depolymeriseren zodat teweeg te SAC zoals in figuur 4 10. Figuur 4. Mad2 is essentieel voor colchicine-ingeroepen SAC functie 10. GFP-cdc20; mad2 + / +, GFP-cdc20; mad2 EY (mad2 – / – null mutant) en GFP-mad2; mad2 EY embryo's werden behandeld met colchicine door micro-injectie. Time-lapse confocale beelden werden genomen voor (01, 07 & 13) of na injectie (02-06, bovenste panelen, 08-12, midden-panelen, 14-18, onderste panelen). GFP-Cdc20 (bovenste en middelste panelen) of GFP-Mad2 (onder) kinetochoor signalen werden gebruikt als celcyclus markers. Top paneel, de pijlen geven de gearresteerde kinetochoren in 02-06. Het gebied met een pijl in 01 blijkt dat voor colchicine behandeling GFP-CDC20 is uitgesloten van het einde van de interfase kern. Midden-paneel, in de afwezigheid van endogene Mad2, GFP-Cdc20 signalen nog steeds in en uit oscilleren van de kern, en op en naast de kinetochoren, hoewel cytokinese lijkt defect is, zoals verwacht in embryo's ontbreekt microtubuli, in aanwezigheid van colchicine (aangegeven met pijlen in 07-12) duidt op een mislukte SAC functie bij de arrestatie van cellen in reactie op colchicine behandeling. Scheiding van dochter kern niet in beeld 10. Onderste paneel, pijlpunten in 14-18 geven gearresteerd kinetochoren met de geaccumuleerde GFP-Mad2 fusie-eiwitten van de functionele GFP-Mad2 suggereren in redding van de SAC defect fenotype in Mad2 mutant embryo. Arrowhead in 13 geeft aan GFP-Mad2 accumulatie in een laat interfase kern. Bar = 5mm. De embryo's werden gemicroinjecteerd met ~ 1% ei volume van een 100mg/ml colchicine voorraadoplossing in 1 x PBS.