La colonizzazione delle Euprymna scolopes Squid da Vibrio fischeri</em
Summary
Il metodo descrive la procedura con cui il calamaro hawaiano bobtail,<em> Euprymna scolopes</em> E il suo simbionte batterica,<em> Vibrio fischeri</em>, Vengono allevati separatamente e poi introdotta per consentire colonizzazione specifica dell'organo luce calamari dai batteri. Rilevamento colonizzazione da parte di luminescenza batteri derivati e conteggio delle colonie diretta sono descritti.
Abstract
Batteri specifici sono presenti in associazione con tessuti animali 1-5. Tali host-batteriche associazioni (simbiosi), può essere dannoso (patogeno), non hanno alcuna conseguenza fitness (commensale), o essere di beneficio (mutualità). Mentre molta attenzione è stata data alle interazioni patogeni, si sa poco sui processi che determinano l'acquisizione riproducibile di benefici / commensale batteri dall'ambiente. La luce-organo mutualismo tra la marina batterio Gram-negativo V. fischeri e la Hawaiian Bobtail calamari, E. scolopes, rappresenta una interazione altamente specifica in cui un host (E. scolopes) stabilisce un rapporto simbiotico con una sola specie batteriche (V. fischeri) nel corso della sua vita 6,7. Bioluminescenza prodotta da V. fischeri durante questa interazione fornisce un anti-predatorio beneficio E. scolopes durante le attività notturne 8,9, mentreil tessuto ricco di nutrienti host fornisce V. fischeri con una nicchia protetta 10. Durante ogni generazione host, questo rapporto si riassume, rappresentando così un processo prevedibile che può essere valutata in dettaglio vari stadi di sviluppo simbiotico. In laboratorio, del minore calamari sportello aposymbiotically (colonizzati), e, se raccolti entro i primi 30-60 minuti e trasferito al simbionte priva di acqua, non possono essere colonizzati se non lo sperimentale inoculo 6. Questa interazione fornisce pertanto un sistema utile modello in cui per valutare i singoli passaggi che portano alla acquisizione specifico di un microbo simbiotico dall'ambiente 11,12.
Qui si descrive un metodo per valutare il grado di colonizzazione che si verifica quando appena schiusi aposymbiotic E. scolopes sono esposti a (artificiale) contenenti acqua di mare V. fischeri. Questo saggio descrive semplice inoculazione, l'infezione naturale, e il recuperodel simbionte batterico dall'organo luce nascente E. scolopes. cura è presa per fornire un ambiente coerente per gli animali durante lo sviluppo simbiotico, con particolare riguardo alla qualità dell'acqua e segnali luminosi. Metodi per caratterizzare la popolazione simbiotica descritta includono (1) misura della bioluminescenza batteri-derivati, e (2) colonia diretta conteggio di simbionti recuperati.
Protocol
Discussion
Il dosaggio colonizzazione descritto permette l'analisi di un processo naturale simbiotico in un ambiente di laboratorio controllato. Come tale, può essere utilizzato per valutare colonizzazione da ceppi mutanti mediante diversi isolati naturali, e sotto regimi chimici differenti. Variazioni su gli esperimenti descritti sono comunemente usati per valutare diversi aspetti della simbiosi. La cinetica di colonizzazione può essere misurata esaminando luminescenza durante le prime 24 ore, che può essere rilevata autom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano per il supporto Mattias Gyllborg impianto di calamari e dei commenti a questo manoscritto, Michael Hadfield e il Laboratorio Kewalo Marine per l'assistenza durante la raccolta campo, ei membri del Laboratorio di Ruby e McFall-Ngai per i contributi a questo protocollo. Il lavoro nel laboratorio di Mandel è supportato da NSF IOS-0843633.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
