Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

1. Déglycosylation enzymatique Utiliser des tubes de PCR afin de minimiser la perte d'eau due à l'évaporation. Repérer un ensemble de tubes 1 à 7. Décongelez le tampon 10X G7, le tampon 10X glycoprotéine dénaturation, et les 10% NP-40 et tapotez doucement les tubes pour mélanger le contenu. Conserver à température ambiante. Placer les flacons contenant des enzymes sur la glace. Essayez de minimiser le dégel / gel cycles. Dissoudre le contenu du flacon hCGβ (150 ug) dans 600 pi de dH 2 O et de garder sur la glace. Préparer 1 ml de tampon 1X G7 en diluant le stock 10X en DH 2 O. Diluer 0,5 pl de la PNGase F dans 25 pi de tampon 1X G7 et de garder sur la glace. Préparer le mélange exoglycosidase (mix EG) en combinant 2 pl chacune des α-N-acétylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 galactosidase, et α1-3, 6 galactosidase. Mettre en place des tubes de PCR comme indiqué: ak »> Tube / échantillon # 1 2 3 4 5 6 7 hCGβ (0.25mg/ml) 9μl 9μl 9μl 9μl – – – Glycoprotéine 10X tampon dénaturant 1 microlitre 1 microlitre 1 microlitre 1 microlitre 1 microlitre 1 microlitre 1 microlitre dH 2 O – – – – 9μl 9μl 9μl Boucher les tubes, mélanger délicatement et placer dans lethermocycleur, fermer le couvercle et dénaturer les protéines par incubation de 10 minutes à 94 ° C, suivie d'un 4 ° C détiennent (en utilisant des tubes PCR dans un thermocycleur empêche grandement l'évaporation dans les échantillons de petit volume). Retirer les tubes du thermocycleur et centrifugeuse pour éliminer toute condensation visible. Ajouter les réactifs suivants comme indiqué: Exemple # 1 2 3 4 5 6 7 10% de NP-40 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl Tampon 10X G7 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5 & mu; L 2.5μl PNGase F 01h50 dil. – 2μl – – 2μl – – Mélanger déglycosylation – – 2μl 2μl – 2μl 2μl Mélangez EG – – – 2μl – – 2μl dH 2 O 10 ul 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl Vol total de la réaction. 25 L μ 25 L μ 25 L μ 25 L μ </ Td> 25 L μ 25 L μ 25 L μ Fermer les tubes PCR utilisant des amorces de nouvelles (jeter celles qui sont utilisées car elles ne s'adaptent pas correctement après un cycle d'incubation). Mélanger les tubes en tapotant délicatement 4 fois, puis tourner le contenu vers le bas. Placer les tubes dans le thermocycleur et incuber à 37 ° C pendant 4 heures puis laisser refroidir les échantillons à 4 ° C. 2. SDS-PAGE des échantillons déglycosylé Préparer 130 ul de tampon frais 3X réduction de la charge de SDS en ajoutant 4 pi de TNT 1.25M. Ajouter 12,5 ul de la mémoire tampon 3X préparés de chargement réduisant SDS à chaque échantillon. Fermer les tubes avec des bouchons de nouvelles et tapotez doucement les tubes pour mélanger. Incuber les tubes dans un thermocycleur à 94 ° C pendant 5 minutes puis refroidir à 4 ° C. Charge 30 ul de chaque échantillon et 10 pi de la protéine de marqueur sur un 10-20% Tris-Glycine gel. Enregistrer le reste de l'échantillon pour la partie 3.1. Charge 10 pi de marqueur protéique ColorPlus précolorés. Electrophorèse gel à 130 volts à température ambiante jusqu'à ce que le front se trouve près du bas du gel. Lorsque le gel a fini, enlever le gel de la fonte et le placer dans une petite boîte en plastique avec assez de Coomassie bleuissement pour couvrir le gel. Stain le gel pendant 1 heure sous agitation douce. Lavez les trois moments de gel pendant 30 minutes dans 50 ml de solution Décolorer. Enregistrez les images en utilisant un transilluminateur lumière blanche ou un scanner. Sinon, le gel peut être séché entre des feuilles de cellophane dans un cadre. 3. Pro-Q Emerald 300 pour la détection des protéines glycosylées de gels SDS-PAGE En parallèle avec le gel de 2,1), charge le reste des échantillons sur un 10-20% Tris-Glycine gel. Charge 10 & mu; L de protéines marqueurs ColorPlus précolorés. Alors que le gel est en marche dissoudre le réactif Pro-Q émeraude avec du DMF et de préparer le correctif stock, Laver et oxydantes des solutions pour l'Emeraude de Pro-Q 300 tache suivant le manuel du produit fournie avec le kit. Lorsque l'électrophorèse est terminée, enlever le gel de fonte et le placer dans une boîte en plastique. Fixer le gel en ajoutant 100 ml de la solution Fix et c'est une nuit à température ambiante sous agitation douce. Laver le gel avec 100 ml de la solution de lavage de 10 à 20 minutes à température ambiante sous agitation Gentile. Répéter le lavage avec la solution de lavage frais. Oxyder les hydrates de carbone en incubant le gel avec une agitation douce pendant 30 minutes dans 25 ml de solution oxydante. Laver le gel comme décrit dans l'étape 3.5. Alors que le gel est de préparer le lavage douce Pro-Q Emerald 300 tache en ajoutant 500 pl de la solution Pro-Q Emeraude réactif dissous 300 à l'étape 3.2 à 25 ml decoloration tampon fourni dans le kit. Stain le gel en ajoutant 25 ml de la tache préparé à l'étape 3.8 et l'incubation dans l'obscurité sous agitation douce pendant 90 à 120 minutes. Répétez les deux étapes de lavage décrite à l'étape 3.5. Enregistrer les images avec un transilluminateur d'UV à 300nm. Utilisez le marqueur de 80 kDa, qui est étiqueté avec Pro-Q vert émeraude, le chevauchement de l'image à une image UV lumière blanche du gel montrant l'échelle précolorés. Comparez les images du gel Coomassie teinté à l'étape 2.10 avec le gel d'Emeraude Pro-Q teinté de l'étape 3.11. 4. Les résultats représentatifs Les changements dans la migration des protéines enzymatiques après déglycosylation sont présentés dans la figure 2. Comparer l'échantillon de contrôle (panneau A, ligne 1) avec le traitement PNGase F (élimination des N-glycanes, piste 2), et Mix déglycosylation (PNGase F; ainsi endo-et exoglycosidases pour enlever O-glycanes, piste 3). Aucune autre réductionla taille est observée après digestion par des glycosidases supplémentaires (piste 4). Outre un changement de masse, les bandes deviennent plus nettes que les glycanes sont supprimés. Une bande fonctionnant sous le marqueur de 17 kDa (astérisque) représente l'parfaitement déglycosylé hCGβ polypeptide (MW: 16 kDa). D'autres bandes pourraient découler de déglycosylation incomplètes ou multiples à partir des protéines non identifiés présents dans l'échantillon hCGβ (voir ligne 1). Lanes 5 à 7 (contrôles) montrent les bandes correspondant aux glycosidases. La coloration par le vert émeraude glycoprotéine est montré dans le panneau B. Ce réactif s'oxyde et les taches de tous les glycanes présents dans une molécule de protéine. Par conséquent, l'intensité du signal diminue à mesure que hCGβ est enzymatiquement déglycosylé (voies 1 à 4 voies). Le signal résiduel dans les couloirs 3 et 4 indiquent la présence de motifs glycane, qui sont résistants aux enzymes utilisées. Les glycosidases supplémentaires utilisées dans la piste 4 enlever un peu de résidus de sucre supplémentaire: la migration des protéines est le même, maisune légère réduction de l'intensité de la coloration peut être vu. Fractions de sucre résistant n'étaient pas présents dans toutes les espèces de protéines: certaines bandes n'ont pas été détectés par Emerald Green (absente dans l'image UV, entre parenthèses), indiquant qu'ils ont été largement déglycosylé. Des données additionnelles de soutien à la conclusion que hCGβ est hétérogène glycosylée. La bande inférieure sur la voie 2 (flèche) est faible sur l'image vert émeraude, tandis que la bande supérieure sur la piste 2 est lumineux, ce qui indique que de nombreux groupes de glycanes sont toujours présents. Ces données appuient la conclusion que hCGβ recombinant exprimé dans des cellules de souris contient glycoformes multiples 9. Ces glycoformes différentes sont dues à l'hétérogénéité inhérente de la glycosylation des polypeptides où certains ne reçoivent pas un glycane dans chaque site de consensus et / ou certains glycanes sont étendues tandis que d'autres, même sur la même protéine ne sont pas. Figure 1.Modèles de glycosylation typiques pour sécrétée ou glycoprotéines de surface cellulaire. Figure 2. Gels SDS-PAGE montrant déglycosylation enzymatique de hCGβ. Le panneau A montre une coloration bleue Coomassie tout panneau B montre les résultats de Pro-Q Emerald 300 pour la visualisation des protéines glycosylées. Numéro de l'échantillon: 1, le contrôle hCGβ; 2, PNGase F digestion; 3, la digestion Mix déglycosylation; 4, ainsi que la digestion Mix déglycosylation exoglycosidases, des échantillons de 5 à 7 sont les contrôles réactifs (O-Glyc, O-glycosidase; GNA, β-N acétylglucosaminidase; Fucosidase Gal / FUC, β1-3 galactosidase, α1-3, 6 galactosidase, et α1-2; Galna, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, la neuraminidase; PNGase; PNGase F)