הערכת הביטוי GFP ואת הכדאיות שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מבחני כדאיות התא ביטוי הקרינה באמצעות Cytometer תמונה מבוסס טלי.
Abstract
תא בודד ומידע האוכלוסייה מתקבלים בדרך כלל או על ידי זרימת cytometry או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, אלה שתי שיטות לספק מידע שונים. Cytometry זרימה נותן מידע כמותי רב פרמטרית על מאפיינים פיזיים מכתים או ביטוי, אבל אינו מאפשר ראיה. עצמאיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספקת נתונים חזותיים, אך אינו מאפשר מדידה כמותית פשוטה 1.
תמונה מבוססי cytometry מגשר על הפער בין שתי השיטות, המאפשר הדמיה מהירה ניתוח כמותי סימולטני של אלפי תאים אוכלוסיות הטרוגניות 2. כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע כדאיות התא ירוק ניאון (GFP) חלבון מבחני ביטוי באמצעות Cytometer טלי מבוסס תמונה 3. המכשיר טלי היא פלטפורמה 3 ערוצים (שדה בהיר, ירוק פלואורסצנטי, אדום פלואורסצנטי) benchtop assay כי offers מספר יתרונות על פני cytometry זרימת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Cytometer טלי פחות יקר, תופס ספסל פחות, דורש פחות תחזוקה, ואת זרימת העבודה הופשטה, כך פעולת ניתוח הרבה יותר פשוט ומהיר. Cytometer טלי הוא מסוגל לבצע מגוון של תא המבוססת על מבחני ההשעיה, כולל ה-GFP ואדום ביטוי ניאון (RFP) חלבון, אפופטוזיס 4-6 ו כדאיות התא ניתוח עם יודיד propidium (PI) 11/07.
הנה, אנחנו מדגימים את השימוש במכשיר טלי בביצוע כדאיות התא assay בתאים לבטא GFP. GFP-transduced התאים הם מוכתמים באמצעות ערכת ליכולת הקיום טלי – Red Cell המלח. התאים pipetted מכן לתוך שקופיות ניתוח טלי נייד וטעון cytometer. השדה מואר, אדום פלואורסצנטי ותמונות פלואורסצנטי ירוק נלכדים ונותחו באמצעות אלגוריתמים assay ספציפיים. Histograms נוצרות אז לתצוגה גודל התא, PI fluoעוצמת rescence, ועוצמת הקרינה ה-GFP. פרמטרים אלה לאחר מכן ניתן thresholded להתביית על אוכלוסיית תאים מסוים.
תופעות לוואי על ידי השוואה של Cytometer טלי תמונה מבוססי זרימת cytometry המסורתית מוכיח כי שתי השיטות מספקים נתונים השוואתיים לגבי הכדאיות התא ביטוי חלבון. עם זאת, מכשיר טלי מספק מידע חזותי נוסף על אוכלוסיית תאים שלא ניתן להשיג באמצעות cytometer לזרום.
Protocol
Discussion
יש לנו נוהל מפורט רק עבור ביצוע ספירות כדאיות והערכת הביטוי GFP באמצעות תמונה מבוסס טלי Cytometer. שימוש באותו הליך, cytometer זה הוא מסוגל לבצע מספר מבחני אחרות, לרבות: אפופטוזיס, RFP ותא ניתוח כדאיות השימוש הלא transduced תאים.
מבחני Fluorometric של כדאיות התא, ביטוי גנים אפופטוזיס הפכו מתודולוגיות מפתח במחקר ביו 7-12. ב המכשור, בעבר נפרדים נעשה שימוש כדי לקבל מידע כמותי על תאים חזותי. בעוד שמידע כמותי על תאים בתוך אוכלוסיה הטרוגנית כבר צבר באמצעות cytometry זרימה, מידע חזותי או איכותי נאסף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 1-4. כאן, אנו מציגים טכנולוגיה אשר מגשר על הפער בין האוכלוסייה לימודי תא יחיד. שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי, כמותי data ונתונים תא חזותי על תאים בודדים או אוכלוסיות תאים ניתן לאסוף בעת ובעונה אחת. המכשיר טלי יכול לשמש עבור מגוון של יישומים, כולל הערכה של ביטוי גנים, מבחני אפופטוזיס, מחקרים על יעילות התרופה, והערכה של התקדמות המחלה.
תמונה מבוסס טלי לוכדת Cytometer ומנתח בהיר שדה, פלואורסצנטי אדום ותמונות פלואורסצנטי ירוק, המאפשר מידע על subpopulations של תאים שיופק. לדוגמה, assay הזה, היינו יכולים להבחין בין תאים מתים מן התאים לחיות בתוך האוכלוסייה-GFP להביע התא באמצעות המלח צבען האדום Cell. זה נותן דיוק במדידה של תאים קיימא להביע GFP, ומזהה את אוכלוסיית התאים שמיש עבור עיבוד במורד הזרם. חשוב לציין כי התאים המתים באוכלוסייה יכולה לנבוע ממקורות שונים, כולל מוות של תאים נורמליים בתרבות או מוות של תאים הנגרם על ידי תנאים סביבתיים (למשל, trypsinization או דהATH המושרה על ידי שיטה transfection / התמרה הנבחר).
כאן אנו מדגימים את השימוש cytometer טלי עם תאים U2OS. בשיטות דומות ניתן לבצע באמצעות בתאי יונקים ביותר חרקים. עבור כל קו התא, מיוצר cytometer טלי ביטוי כמותי GFP נתונים, דבר שאינו אפשרי עם בדיקה ויזואלית של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. למרות התוצאות הללו דומים cytometry זרימה, הם נאספים בשבריר של זמן. Cytometer מסוגל לספור במדויק את התאים בין 5 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר קוטר, רצוי בריכוז של 1 x 05-01 אוקטובר 7 x 10 תאים / מ"ל.
חשוב לציין כי מכתים פרוטוקולים סטנדרטיים ביותר, לרבות פרוטוקול מכתים המלח Red Cell המתואר כאן, להשתמש יודיד propidium להבחין בין תאים חיים ומתים. זה מציב אתגר כאשר להערכת הכדאיות בתאים שהיו permeabilized עבור רחובaining של סמנים תאיים, שכן לצרכן יהיה כתם לכל תא עם קרום בסכנה. מאז כל צבע חלבון פלואורסצנטי או כי ניתן לאתר את ערוצי פלואורסצנטי ירוק או אדום ניתן לנתח על Cytometer טלי מבוסס תמונה, מחקרים עתידיים עשויים לבדוק את השימוש של צבעים חלופית, כגון צבעי אמין הכדאיות תגובתי 4. מחקר שנעשה בשנת 2006 על ידי Perfetto et al. 12 נמצא צבעים אלה כדי להיות קלה לשימוש לשעתקו להפלות אוכלוסיות תאים חיים ומתים.
שים לב טלי יש מגבלות לגבי סוגי מבחני זה יכול לבצע. לדוגמה, מאז המטרה בשימוש על ידי המכשיר היא 4X, מבצעים ספירה מוגבלים סוגי תאים גדולים: המשנה הסלולר מבנים כגון המיטוכונדריה או שלפוחית, וכן תאים חיידקיים לא ניתן לכמת. כמו כן שים לב הערוצים גילוי טלי מוגבלים fluorophores שילהיב פולטים בתוך הערוצים. בעוד YFP ובהיר mCherry אותות גלהתגלות, דימר אותות mCherry לא יכול. לבסוף, טלי רק מנתח את התאים בתרחיף. זה לא מדויק לספור תאים דבקות לשקופית. יתר על כן, בעוד שיש רק יכולת מוגבלת לספור תאים מעוצבים באופן בלתי סדיר, כולל שמרים מסוימים תאים ראשוניים.
בנוסף, מחקרים בעתיד צפויה כתובת השימוש במערכת זו בהערכת ביטוי של סמנים תאיים. צבעים בודדים ניתן לבדוק עבור חפיפה ספקטרלית עם ערוצים סמוכים, באמצעות כלי SpectraViewer המקוונת של Invitrogen ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). לאור החידוש בטכנולוגיה זו, מגוון רחב של יישומים טרם גילו.
לסיכום, Cytometer תמונה מבוסס טלי הפגינו כאן מציגה טכנולוגיה חדשה המאפשרת הדמיית ניתוח סימולטני של אוכלוסיות תאים, המאפשרת הערכה של תאים בודדים, כמו גם celאני אוכלוסיות בפורמט קומפקטי עם זרימת עבודה פשוטה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
| U2OS cells |
References
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell’Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
