Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em> In Vivo</em> Elektroporatie

De zoogdieren binnenoor heeft 6 verschillende sensorische epitheel: 3 cristae in de ampullen van de halfcirkelvormige kanalen, maculae in de utricle en sacculus, en het orgaan van Corti in de opgerolde slakkenhuis. De cristae en maculae bevatten vestibulaire haarcellen die transduceren mechanische stimuli om de speciale gevoel van evenwicht dienstig zijn, terwijl de auditieve haarcellen in het orgaan van Corti zijn de primaire transducers voor het horen van ^1. Lot van de cel specificatie in deze sensorische epitheel en morfogenese van de halfcirkelvormige kanalen en het slakkenhuis vindt plaats tijdens de tweede week van de zwangerschap in de muis en zijn grotendeels voltooid voor de geboorte ^2,3. Ontwikkelings-studies van de muis binnenoor worden routinematig uitgevoerd door het oogsten van transgene embryo's op verschillende embryonale of postnatale fase inzicht te krijgen in de moleculaire basis van cellulaire en / of morfologische fenotypes ^4,5. Onze hypothese is dat genoverdracht naar de ontwikkelingslanden muis binnenoor in de baarmoeder </ Em> in het kader van de winst-en verlies-van-functie studies is een gratis benadering van de traditionele muis transgenese voor de ondervraging van de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan zoogdieren binnenoor ontwikkeling ^6.

De experimentele paradigma om gen-misexpression studies uit te voeren in de ontwikkelingslanden muis binnenoor aangetoond hier is opgelost in drie algemene stappen: 1) ventrale laparotomie, 2) transuterine micro-injectie, en 3) in vivo elektroporatie. Ventrale laparotomie is een muis te overleven chirurgische techniek die uitbesteding van de baarmoeder toelaat te krijgen experimentele toegang tot de geïmplanteerde embryo's ^7. Transuterine micro-injectie is het gebruik van schuine, glazen capillaire micropipetten tot expressie plasmide in het lumen van het otic blaasje of otocyst te introduceren. In vivo elektroporatie is de toepassing van blokgolf, gelijkstroom pulsen om de expressie plasmide rijden progenitorcellen ^8-10.

<p clkont = "jove_content"> We hebben eerder beschreef dit elektroporatie op basis van gen-overdracht techniek en gedetailleerde opmerkingen opgenomen op elke stap van het protocol ^11. Muis experimentele embryologische technieken kan het moeilijk zijn om te leren van proza ​​en foto's alleen. In dit werk, tonen we de 3 stappen in de genoverdracht procedure. De meeste kritisch, zetten we digitale video-microscopie om precies te laten zien hoe je: 1) het identificeren embryo oriëntatie in de baarmoeder; 2) embryo's te heroriënteren voor het richten van injecties langs de otocyst; 3) microinject DNA gemengd met kleurstof tracer oplossing in de otocyst op embryonale dag 11.5 en 12,5; 4) electroporate de ingespoten otocyst, en 5) label geëlektroporeerd embryo's voor postnatale selectie bij de geboorte. Wij bieden representatieve voorbeelden van succesvol getransfecteerd innerlijke oren, een geïllustreerde gids voor de meest voorkomende oorzaken van otocyst mistargeting, bespreken hoe de gemeenschappelijke methodologische fouten te vermijden, en de huidige richtlijnen voor het schrijven van een in de baarmoeder gENE overdracht verzorging van dieren protocol.