Одновременная запись кальция Сигналы от выявленных нейронов и пищевое поведение DROSOPHILA MELANOGASTER</em

1. Построение МУХИ Форма платформы крышкой 35 мм блюдо Сокол путем плавления боковин и разрезал его, чтобы сформировать соответствующий угол и толщину (рис. 1а, 2). Просверлите отверстие в платформе принять лету головы (рис. 1а, б), что ротовые свободно подвергаться за пределами камеры (рис. 1а). Отрежьте конец наконечника Pipetman, с размерами соответствующий лету быть соблюдены. Клей наконечник на платформу, как показано на рисунке 1а завершить мух (рис. 2). 2. Подготовка Fly для наблюдения Голодать взрослых мух в течение 24 часов при 25 ° С до эксперимента, поместив его в сосуд с только влажное бумажное полотенце, если голод не требуется. Обезболить лету, поместив его в 15 мл пластиковая трубка стояла на льду. Используя щипцы, вставьте муха в камеруМух, и аккуратно вставьте в лету, пока он не может двигаться. Затем вставьте вилку, чтобы сохранить лету. (Рис. 1а, б). Печать окружающие части проксимального отдела хоботка (трибуны) до внутреннего края отверстий, нанесите небольшое количество света отверждения клея (Tetric EvoFlow) по бокам и над трибуной извне (стрелки на рисунке 3). Также применяется клей изнутри мух в пространство между спинной части головы и внутренние края отверстия (рис. 1б). Чтобы трибуны свободно передвигаться, следует проявлять осторожность, чтобы предотвратить любой клей от прикосновения к трибуне с помощью ресниц (или что-то сопоставимы) распространять клея. И наконец, вылечить клея с самым слабым освещением синим светом достаточной для лечения, чтобы избежать повреждения лету от чрезмерного тепла. Выдерните штепсель из розетки. Нить провести трибуны частично снимается (стрелка на рисунке 3) могут быть использованы для стабилизации лету "голова, избегая удара в глотки частично SOG и разоблачить вентральной части SOG, особенно для работы с изображениями пресинаптические терминалы Gr5a нейронов 8, на которые распространяется части глотки, когда хоботок полностью убирается. Заполните поверхности платформы без сахара солевой содержащий (в мМ): NaCl, 140, KCl, 2, 2 MgCl, 4.5, 2 CaCl, 1,5 и HEPES-NaOH, 5 с рН 7,1 10. Это сахарозы без солевой имеет аналогичные тонус тем, наиболее часто используемых содержащие сахарозу, таких как солонцы HL3.1 11. Откройте головной капсулы помощью лезвия вольфрама и пинцет с заостренными советы, как ножницы, которые на заказ устройства и первоначально разработана доктором Kageyuki Ямаока, Японии, обрезать кутикулу и трахеи, чтобы разоблачить SOG (рис. 4). Нижний край головы кутикула была сокращена, как вентральный возможно в то время как спинной среза было не так критично. Во-первых, сделать надрез черезЗадний край помощью вольфрама лезвие. Затем разрезать сбоку и передние края, используя заостренные щипцы. Отрезанный кусок кутикула должны быть сняты с щипцами и удалить. Антенны и усиков нервы должны быть вырезаны заостренной щипцами. Для того чтобы избежать артефактов движения во время записи, мозг должен быть стабилизирован путем удаления некоторых частей лету. Во-первых, выборочно удалить воздух мешков между ГСК и кутикулы. Вырезать пищевода в конце к глотке и в конце вдаваясь в SOG, чтобы удалить связь между глоткой и мозга. Затем потяните мышцы из 16 12 и, наконец, отделить любой трахеи подключения мозга и кутикулы. Мы ставим мух на стадии микроскоп Olympus BX51WI связана с вращающимся диском конфокальной микроскопии системы (Improvision в PerkinElmer) (рис. 5). Объектив погружения в воду, например, 40X/0.8 Н.А., был погружен в ванну (рис. 6 </strong>). 3. Са 2 + изображений мозга Са 2 + визуализации с использованием GCaMP3.0 1, 9 было выполнено с помощью метода установленном Marella и соавт. 8 (рис. 6). С помощью вращающихся дисков конфокальной микроскопии (Improvision), принять единую оптическую часть на 4 Гц с выдержкой 122ms использованием 491nm лазерного возбуждения, сосредоточив внимание на области, представляющие интерес (клетки тела двигательных нейронов, или интернейронов или пресинаптические терминалы вкусовых сенсорных нейронов) со скоростью программного обеспечения, версии. 4.3 (Improvision). 4. Стимулирование Хоботок Аспирируйте 100mM водный раствор сахарозы в шприц с небольшой фитиль (из японской бумаги васи, см. таблицу конкретных реагентов) торчащие из наконечника (рис. 7). Разряд небольшую каплю раствора сахарозы на фитиль, то, аспирации, немедленно ДОприменение электронной бумаги пропитанной Васи фитиль на кончике хоботка. Фитиль Васи бумаги следует применять только на мгновение, чтобы избежать насыщения (рис. 8). Следить за ответ Хоботок Extension (PER) поведение с помощью камеры CCD придает рассечение микроскоп (рис. 5) одновременно с Са 2 + изображения. Данные должны быть приняты в течение одного часа после начала вскрытия, так как PER ответ не поддерживается более одного часа в таких условиях. 5. Представитель Результаты Моторные нейроны трибуны транспортир, пара крупных мышц, ответственных за снятие трибуны для расширения хоботок, были зарегистрированы, чтобы показать надежный ответ на сладкое стимулы 13. Рисунке 9 показано, Ca 2 + сигналов через GCaMP3.0 1, 9 выраженные Гал 4 водителя, E49 13, от тела клетки нейрона двигатель. Как показано на видео, Робуул НА наблюдается синхронно с увеличением Ca 2 + сигнала. Рисунок 1. Схема Fly мозга Онлайн визуализации и электрофизиологии этап (мухи). , мух построена таким образом, чтобы угол наклона стен позволяет лету головы, чтобы выйти прямо. Три отрезка лету хоботком имеют цветовую маркировку, трибуны является пурпурный. Муха вставляется в камеру с пинцета, и кусок вырезан из конца наконечник Pipetman подключен к задней части камеры, чтобы блокировать лету убежать. Б, отверстие скучно, чтобы они соответствовали голову мухи. Оставшиеся пробелы уплотнены светоотверждаемых клей, как показано, чтобы нет утечек. После того, как клей вылечил, кончик Pipetman как плагин будет удален. Соленая заливается в мух, что поверхность головного мозга была полностью закрыта. Следует обеспечить, что нет утечки солевойПроисходит как бы на переднем конце лету головы. Затененные области, окруженной пунктирной линии на панели б показана часть будет иссекали. Рисунок 2. Фотография мух. Полумесяца стене клеем (с клеевой пистолет) состоит, чтобы управлять потоком физиологического раствора во время перфузии, а также уменьшить количество физиологического раствора используется. Рисунок 3. Фронтальный вид мухи установлен в мух. Это изображение показывает, как муха находится в мух, и, как светоотверждаемых клей наносится вокруг головы муха (стрелки), чтобы создать физиологическим раствором доказательство печатью. Если солевой утечки до хоботок мухи, то эксперимент не удастся. Нить (стрелки) привязаны к стадии проведения хоботок в положении, так что это не совсем retrac Тед. В противном случае он будет препятствовать более брюшной части SOG и вызывает движение артефакты. Рисунок 4. Топ-вид мух с расчлененным мухи. Это изображение показывает открытые SOG из мухи после удаления кутикулы. Пищевода, мышц 16 и трахеи связаны с мозгом, а также отдельных воздушных мешков, также были удалены, чтобы не допустить их нарушения головного мозга, что может привести к артефактам в кальциевых сигналов. Рисунок 5. Аппаратура контроля. Этот аппарат собран из микроскоп Olympus BX51WI прикреплены к вращающимся диском конфокальной микроскопии системы (Improvision), а также боковыми Nikon SMZ800 микроскопом. Эта установка позволяет живого изображения мозговой деятельности при PER поведения. 6 "SRC =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/> Рисунок 6. Фотографии, чтобы показать вид сбоку от мух. Тонкий слой физиологического раствора зажат между 40X воды погружения линз и лету. Рисунок 7. Схема для изготовления фитиля Васи бумаги. Gampi-Васи работы является традиционной японской пергамент, что является чрезвычайно тонкой и гладкой (Haibara, Япония). Кроме того, очень сильны и могут сохранить большое количество жидкости. В статье Васи должны быть обрезаны в трапеции с очень специфическими размерами, 0,3 мм и 0,7 мм в ширину и 4-5 мм в длину (а). Это трапеции затем вставляется в 0,7 мм в сторону кончика иглы 23 G подкожный, а также может быть стабилизирована путем включения насекомых вывод, который наклонился, чтобы V-образную форму (б). С, бумаги Васи становится прозрачными в результате воздействияв жидкости, что делает его идеальным для этого эксперимента. Рисунок 8. Стимуляция хоботком на мух Васи-фитиль. Фитиль Васи бумагу на кончике иглы подкожно применяется для мгновенной помощи джойстика манипулятор с одной стороны. Иглы соединены через гибкую трубку с инжектором манипулировать с другой стороны, для аспирационных и выгрузки раствора сахарозы. Рисунок 9. Представитель результаты. , PER поведение записываемого с помощью ПЗС-камеры установлены на стереомикроскопа. Фронтальный вид голодных мух с расширенным хоботок (стрелки) до стимуляции, при стимуляции, и после стимуляции с фитилем, содержащего 100 мМ сахарозы водном растворе (стрелки). Подсветка осуществляется с помощью 491 нм лазер, используемыйдля GCaMP флуоресценции. б, сахароза-индуцированной GCaMP 3,0 ответ в двигательный нейрон для транспортир с трибуны мышц голодного государства. На верхней панели, перед стимуляцией, нижняя панель, сразу после стимуляции. Шкала бар, 10 мкм. С, количественная оценка сахарозы вызванного ответа GCaMP 3.0. Двигательный нейрон реагирует на сахарозу стимул к резкому увеличению флуоресценции сопровождается восстановлением фазы от нескольких секунд до базовой линии.