La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

1. Costruire le MOSCHE Forma una piattaforma dal coperchio della piastra da 35 mm Falcon fondendo la parete laterale e intaglio per formare un angolo appropriato e spessore (Figura 1a; Figura 2). Eseguire un foro nella piattaforma di accettare la testa fly (Figura 1a, b), tale che i boccale sono liberamente esposta all'esterno della camera (Figura 1a). Tagliare l'estremità di una punta Pipetman, con la dimensione corrispondente al volo da osservare. Incollare la punta alla piattaforma come mostrato nella Figura 1a per completare le mosche (Figura 2). 2. Preparazione del Fly per l'osservazione Starve uno mosca adulta per 24 ore a 25 ° C prima dell'esperimento ponendolo in un flaconcino con solo un tovagliolo di carta bagnata, fame se è necessario. Anestetizzare la mosca ponendolo in un tubo di 15 ml di plastica in piedi sul ghiaccio. Con pinze, inserire una mosca nella camera delVOLA, e spingere delicatamente la mosca fino a quando non è in grado di muoversi. Quindi, inserire una spina per mantenere il volo. (Figura 1a, b). Sigillare le parti circostanti della prossimali proboscide (rostro) al bordo interno del foro, applicare una piccola quantità di luce La colla (Tetric EvoFlow) ai lati e al di sopra del rostro dall'esterno (frecce in figura 3). Anche applicare la colla dall'interno delle mosche allo spazio tra la parte dorsale della testa e il bordo interno del foro (Figura 1b). Per consentire la tribuna di muoversi liberamente, occorre prestare attenzione per evitare che la colla di toccare il podio utilizzando un ciglio (o qualcosa di simile) per diffondere la colla. Infine, curare la colla con il più debole illuminazione della luce blu sufficienti per la cura per evitare di danneggiare la mosca dal calore eccessivo. Togliere il tappo. Un filo di tenere il rostro parzialmente sollevato (freccia in figura 3) possono essere impiegati per stabilizzare la mosca 'testa di s evitando urto della parte faringea di SOG e per esporre la parte ventrale del SOG, soprattutto per i terminali di imaging presinaptici di neuroni Gr5a 8, che sono coperti da una parte della faringe quando la proboscide è completamente retratto. Riempire la superficie della piattaforma con un senza zucchero contenenti salina (in mM): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4,5, CaCl 2, 1,5, e HEPES-NaOH, 5 con un pH di 7,1 10. Questo saccarosio senza soluzione salina ha tonicità simili a quelli di uso comune contenente saccarosio saline come HL3.1 11. Aprire la capsula testa con una lama in tungsteno e pinze con le punte affilate come forbici, che è un dispositivo su misura e originariamente progettato dal Dr. Kageyuki Yamaoka, il Giappone, per tagliare le cuticole e trachea per esporre il SOG (Figura 4). Il bordo ventrale della cuticola testa è stata tagliata come ventrale più possibile, mentre il taglio bordo dorsale non era così critico. In primo luogo, fare un incisione attraverso l'margine posteriore usando una lama di tungsteno. Quindi, tagliare la parte ed i bordi anteriori con le pinze appuntite. Il pezzo cuticola taglio deve essere sollevato con le pinze e rimossi. Nervi Antenne e antenne dovrebbero essere tagliati fuori dalle pinze appuntite. Per evitare artefatti movimento durante la registrazione, il cervello deve essere stabilizzate mediante l'asportazione di alcune parti della mosca. In primo luogo, rimuovere selettivamente i sacchi aerei tra la SOG e cuticola. Tagliare il esofago alla fine verso la faringe e alla fine entrare nel SOG rimuovere la connessione tra la faringe e il cervello. Quindi estrarre Muscle 16 12, e, infine, staccare qualsiasi trachea che collega il cervello e la cuticola. Abbiamo impostato le nostre mosche sul palcoscenico di un microscopio Olympus BX51WI collegato ad un sistema di rotazione del disco microscopio confocale (Improvision in PerkinElmer) (Figura 5). Una lente immersione in acqua, ad esempio 40X/0.8 NA, è stata immersa nella vasca (figura 6 </strong>). 3. Ca 2 + Imaging of the Brain Ca 2 + immagini utilizzando GCaMP3.0 1, 9 è stata effettuata mediante il metodo stabilito da Marella et al. 8 (Figura 6). Utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Improvision), prendere una singola sezione ottica a 4 Hz con un tempo di esposizione di 122ms con 491nm laser di eccitazione, di messa a fuoco la regione di interesse (un corpo cellulare di un neurone motore, o un interneurone, o terminali presinaptici gustative dei neuroni sensoriali) con software Velocity, ver. 4.3 (Improvision). 4. Stimolare la proboscide Aspirare 100mM soluzione acquosa di saccarosio in un ago ipodermico con uno stoppino piccolo (a base di carta giapponese Washi, vedere tabella di reagenti specifici) sporgente dalla punta (Figura 7). Scaricare una piccola goccia di soluzione di saccarosio sul stoppino, quindi, aspirare, immediatamente before applicando il bagnato stoppino di carta Washi alla punta della proboscide. Lo stoppino di carta Washi deve essere applicata solo per un istante per evitare di sazietà (Figura 8). Monitorare la risposta estensione proboscide (PER) comportamento utilizzando una fotocamera CCD collegata ad un microscopio di dissezione (Figura 5) simultaneamente con Ca 2 + imaging. I dati devono essere prese entro un'ora dopo aver iniziato la dissezione perché la risposta PER non viene mantenuta più di un'ora in queste condizioni. 5. Risultati rappresentativi Motoneuroni del goniometro rostro, una coppia di muscoli principali responsabili per il sollevamento del rostro dell'estensione proboscide, sono stati segnalati per mostrare le risposte robusti agli stimoli dolci 13. Figura 9 mostra Ca 2 + segnali attraverso GCaMP3.0 1, 9 espressa da un Gal 4 driver, E49 13, da un corpo cellulare del neurone motore. Come mostrato nel video, uno Robuv è stata osservata in sincronia con un aumento Ca 2 + segnale. Figura 1. Schema del cervello Fly live Imaging ed Elettrofisiologia Stage (aria). uno, le mosche è costruito in modo tale che l'angolo della parete permette la testa mosca uscire dritto. Tre segmenti della proboscide mosca sono color-coded, il podio è il magenta. La mosca viene inserito nella camera con una pinza, e un pezzo tagliato dalla estremità di una punta Pipetman è connessa al retro della camera di bloccare la fuoriuscita mosca. B, il foro è annoiato conforme alla testa della mosca. Le lacune rimanenti vengono sigillati con la colla luce, come indicato per garantire che non vi siano perdite. Dopo che la colla è asciutta, la punta Pipetman come una presa è stata rimossa. Saline viene versato nei MOSCHE tali che la superficie del cervello è completamente coperto. Occorre garantire che non vi siano perdite salinezare successivamente sull'estremità anteriore della testa mosca. L'area ombreggiata circondata dalla linea tratteggiata in pannello b mostra la parte da sezionati. Figura 2. Fotografia delle mosche. La parete a forma di mezzaluna di colla (una pistola da colla) è fatto per controllare il flusso di soluzione salina durante la perfusione, e per ridurre la quantità di soluzione salina utilizzata. Figura 3. Vista frontale di una mosca montato le mosche. Questa immagine mostra come una mosca si trova nelle mosche e come la luce-colla viene applicata intorno alla testa della mosca (frecce) per creare una soluzione salina a prova di tenuta. Se eventuali perdite saline fino ai proboscide della mosca, poi l'esperimento avrà esito negativo. Il filo (frecce) legato alla fase è di tenere la proboscide in posizione, così che non è completamente retrazione ted. Altrimenti sarebbe ostruire la parte più ventrale del SOG e causare artefatti da movimento. Figura 4. Top-view delle mosche con una mosca sezionato. Questa immagine mostra l'esposto di SOG successivo alla rimozione delle cuticole mosca. L'esofago, Muscle 16 e trachee collegato al cervello, nonchè selezionati aria sacchi sono stati rimossi per impedire loro di disturbare il cervello, che può portare a artefatti nei segnali di calcio. Figura 5. L'apparecchiatura di monitoraggio. Questo apparato è assemblato da un microscopio Olympus BX51WI collegata a un sistema di filatura microscopio confocale disco (Improvision), e un lato montato SMZ800 microscopio Nikon. Questa configurazione permette di live-imaging di attività cerebrale durante PER comportamento. 6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/> Figura 6. Fotografie per mostrare la vista laterale delle mosche. Lo strato sottile di soluzione fisiologica è inserita tra l'acqua 40X-obiettivo a immersione e la mosca. Figura 7. Schema per la realizzazione del stoppino di carta Washi. Gampi-Washi carta è una pergamena tradizionale giapponese che è estremamente sottile e liscio (Haibara, Giappone). È anche molto forte e può mantenere una grande quantità di liquido. La carta Washi deve essere tagliato in un trapezio con dimensioni molto specifici 0,3 mm e 0,7 mm di larghezza, e 4-5 mm in lunghezza (a). Questo trapezoidale viene quindi inserita dal lato 0,7 millimetri nella punta di un ago ipodermico 23 e G può anche essere stabilizzate mediante l'inserimento di un perno di insetto, che è piegata a forma di V (b). C, la carta Washi diventa trasparenti in seguito all'esposizionead un liquido, che lo rende ideale per questo esperimento. Figura 8. La stimolazione della proboscide sulle vola alla Washi-stoppino. Lo stoppino di carta Washi sulla punta di un ago ipodermico viene applicata per un istante utilizzando un manipolatore joystick con una mano. L'ago è collegata tramite un tubo flessibile ad un iniettore manipolato con l'altra mano, per l'aspirazione e lo scarico soluzione di saccarosio. Figura 9. Rappresentativi dei risultati. uno, PER comportamento registrato attraverso la camera CCD installato sul stereomicroscopio. Vista frontale di una mosca affamata con una proboscide estesi (frecce) prima della stimolazione, alla stimolazione, e dopo la stimolazione con uno stoppino contenente 100 mM saccarosio in soluzione acquosa (punta di freccia). L'illuminazione è compiuta da un laser a 491 nm utilizzatoper GCaMP fluorescenza. b, saccarosio-indotta GCaMP 3,0 risposta nel neurone motore per il goniometro del muscolo rostro nello stato affamato. Il pannello superiore, la prima stimolazione, il pannello inferiore, immediatamente dopo la stimolazione. Bar Scala, 10 micron. C, Quantificazione del saccarosio indotta risposta GCaMP 3.0. Il neurone motore risponde ad uno stimolo saccarosio da un forte aumento nella fluorescenza seguita da una fase di ripristino di alcuni secondi per la linea di base.