Summary

Die Beurteilung Somatische Hypermutation in Ramos B-Zellen nach Überexpression oder Knockdown von spezifischen Genen

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

Wir beschreiben, wie retroviralen oder lentiviralen Infektionen der Überexpression oder shRNA-Konstrukte, die in das menschliche Ramos B-Zell-Linie und wie somatische Hypermutation in diesen Zellen zu messen. Durchführen

Abstract

B-Zellen beginnen ihr Leben mit niedriger Affinität Antikörper durch V (D) J-Rekombination erzeugt. Doch beim Erkennen eines Krankheitserregers, wird die Variable (V) Region eines Immunglobulins (Ig)-Gen etwa 100.000-fach stärker als der Rest des Genoms durch somatische Hypermutation (SHM), mutiert wodurch Antikörper mit hoher Affinität 1,2. Darüber hinaus produziert der Klasse Switch-Rekombination (CSR)-Antikörper mit verschiedenen Effektor-Funktionen, je nach Art der Immunantwort, die für einen bestimmten Erreger benötigt wird. Beide CSR und SHM durch activation-induced Cytidindeaminase (AID), die Cytosin-Reste in DNA um Uracile produzieren desaminiert eingeleitet. Diese Uracile sind fehleranfällig Formen der Reparaturwege verarbeitet, was schließlich zu Mutationen und Rekombination 1-3.

Unser gegenwärtiges Verständnis der molekularen Details der SHM und CSR komme aus einer Kombination von Studien an Mäusen, primäre Zellen, Zelllinien und Zell-free Experimente. Mausmodelle bleiben den Goldstandard mit genetischen Knockouts zeigt eine entscheidende Rolle für viele Reparatur-Faktoren (zB Ung, MSH2, MSH6 Exo1 und Polymerase η) 4-10. Allerdings sind nicht alle Gene zugänglich für Knockout-Studien. Zum Beispiel sind Knockouts von mehreren Doppelstrangbruch Reparatur-Proteine ​​embryonal letalen oder beeinträchtigen B-Zell-Entwicklung 11-14. Darüber hinaus manchmal die spezifische Funktion eines Proteins in SHM-oder CSR kann durch weitere globale Defekte, die durch die Ko verursacht maskiert werden. Darüber hinaus können seit Experimente in Mäusen als langwierig, zu verändern Expression einzelner Gene in Zelllinien ist ein zunehmend beliebtes erste Schritt zur Identifizierung und Charakterisierung Kandidatengene 15-18.

Ramos – ein Burkitt-Lymphom-Zelllinie, die konstitutiv erfährt SHM – ein beliebtes Zell-Linie Modell SHM 18-24 Studie. Ein Vorteil der Ramos-Zellen ist, dass sie einen eingebauten günstigen, halb haben-Quantitatives Maß für SHM. Wildtyp-Zellen exprimieren IgM und, wie sie abholen Mutationen, einige der Mutationen knock out IgM Ausdruck. Deshalb Testen IgM Verlust durch Fluoreszenz-activated cell Scanning (FACS) bietet einen schnellen Auslesen für die Höhe der SHM. Eine quantitative Messung der SHM kann durch direkte Sequenzierung der Antikörper-Gene erreicht werden.

Seit Ramos-Zellen schwer zu transfizieren sind, produzieren wir stabile Derivate, die erhöht oder gesenkt haben Ausdruck eines einzelnen Gens durch Infektion der Zellen mit retroviralen oder lentiviralen Konstrukte, die entweder eine Überexpression Kassette oder eine kurze Haarnadel-RNA (shRNA), jeweils enthalten. Hier beschreiben wir, wie wir Ramos Zellen zu infizieren und dann diese Zellen die Rolle bestimmter Gene auf SHM (Abbildung 1) zu untersuchen.

Protocol

1. Probenvorbereitung und Zellen Führen Sie eine mittlere Vorbereitung von DNA (Midiprep) der Überexpression oder shRNA-haltigen Konstrukte und die retroviralen Vektors Verpackung pKat2 oder lentiviralen Verpackung Vektoren pVSV-G, pMDLg / pRRE und pRSV-Rev 25. Verwenden Sie 6 ug DNA für jedes Konstrukt und entweder 4 pg pKat2 (für retrovirale Infektionen) oder 1,5 ug DNA für jedes der pVSV-g, pMDLg / pRRE und pRSV-Rev Verpackung Vektoren (für lentiviralen Infektionen). Bereiten Sie…

Discussion

Wie bereits erläutert, haben Zelllinie Modelle für die Antikörper-Diversifizierung zu einem beliebten Ausgangspunkt, um neuartige Proteine, die verschiedene Schritte Einfluss während Antikörper Diversifizierung zu identifizieren. Wir stellen hier ein Verfahren zur Verwendung Virusinfektion entweder knock-down oder überexprimieren Proteine ​​in der Ramos B-Zell-Linie und dann die Auswirkungen auf SHM.

Für diese Studien nutzen wir sowohl WT Ramos und AID hallo Ramos-Zelle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die pMSCV-AID-I-Thy1.1 und pKat2 Vektoren wurden freundlicherweise von DG Schatz und die pVSV-G, pRSV-Rev und pMDLg / pRRE Vektoren wurden freundlicherweise von BR Cullen.

Materials

Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
6-well clear TC-treated plates Corning 3516  
10 mL BD Luer-Loksyringes BD Medical 309604  
24-well clear TC-treated plates Corning 3526  
96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates Corning 3596  
100 mm TC-treated culture dishes Corning 430167  
Acrodisc syringe filters, 0.45 μm Pall Life Sciences 4604  
Agar Teknova A7777  
Agarose GeneMate E-3120-500  
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/mL in water
BD FACSCanto II flow cytometer BD Biosciences   or similar
BD Falcon round bottom polystyrene tubes BD Biosciences 352054 for FACS
BOSC 23 cells ATCC CRL-11270  
CO2 incubator capable of 37°C      
DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) Sigma D6429  
FBS (fetal bovine serum) Gemini Bio-Products 100-106  
FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody BioLegend 202503 FITC α-Thy1.1
FuGENE 6 Transfection Reagent Roche 11814443001  
HEPES buffer solution Invitrogen 15630-080  
KAPA HiFi DNA polymerase KAPA Biosystems KK2101  
LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder Difco 240230  
MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock Sigma   shRNA vectors
NCS (newborn calf serum) Gemini Bio-Products 100-504  
PBS (phosphate buffered solution) Invitrogen 70011 diluted to 1x in water
PE α-human IgM antibody BioLegend 314508  
PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) Gemini Bio-Products 400-110  
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma 107689 10 mg/mL in water
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495  
Puromycin Sigma P8833 250 μg/mL in water
QIAquick gel extraction kit QIAGEN 28706  
Ramos (RA 1) cells ATCC CRL-1596  
RPMI-1640 medium Sigma R8758  
SuperScript II Invitrogen 18064-022  
SYBR FAST qPCR kit KAPA Biosystems KK4601  
Taq DNA Polymerase Invitrogen 18038-042  
TOPO TA Cloning kit Invitrogen K4520-01  
TRIzol Invitrogen 15596-026  
Wizard SV Genomic DNA purification system Promega A2361  
X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] Growcells C-5687 40 mg/mL in DMSO

References

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Upton, D. C., Unniraman, S. Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes. J. Vis. Exp. (57), e3573, doi:10.3791/3573 (2011).

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