Inibizione assuefazione e prepulse di shock acustici in roditori

1. Protocollo di Progettazione Calibrazione: prima una serie di esperimenti, calibrare gli altoparlanti. Questo è importante in modo che l'altoparlante visualizzare il volume esatto che è stato impostato dallo sperimentatore. Anche calibrare la sensibilità del trasduttore piattaforma delle finestre sussultare secondo il manuale del fornitore. Il trasduttore converte il movimento verticale della piattaforma in un segnale di tensione. Assicurarsi che non ci siano esperimenti in corso durante la calibrazione del sistema, e che tutte le caselle sono calibrati nello stesso modo. i / o funzione: se nuovi ceppi di topi o ratti sono misurati, un ingresso / uscita funzione dovrebbe essere stabilita. Dopo un periodo di acclimatazione di 5-10 minuti con un rumore di fondo costante bianco da 65 a 68 dB (vedi sotto), gli stimoli trasalimento (20 ms rumore bianco) deve essere visualizzato ogni 20 secondi, a partire da circa 70-75 dB. Intensità dello stimolo sussultare sarà aumentato tra ogni stimolo da 2-5 dB fino ad arrivare a 120-130 dB, con conseguente 10-30 prove con stimoli trasalimento (vedi figura 1). Struttura Protocollo: assuefazione e prepulse inibizione può essere misurata all'interno di un protocollo. Il protocollo è suddiviso in un periodo di acclimatazione, un blocco di I (assuefazione), immediatamente seguito da un blocco II (PPI, figura 2). Prima di misurare prepulse inibizione, gli animali devono sempre subire assuefazione sussultare, in modo che attenuazioni spavento a causa di assuefazione non interferiscono con le misure PPI. Periodo di acclimatazione: Ogni volta che viene testato un animale subisce prima una fase di acclimatazione al fine di adattarsi al detentore degli animali, cassetta di trasalimento e rumore di fondo. Durante un periodo di acclimatazione 5-10 minuti, il rumore di fondo costante di 65-68dB di rumore bianco (a seconda del rumore dell'ambiente) viene visualizzato, ma non stimoli sussultare. Durante questa fase l'animale si calma, sosta per esplorare l'ambiente e smettere di muoversi. Blocco I assuefazione: a breve termine assuefazione (STH), tra 30 -100 stimoli trasalimento deve essere applicato sul fondo. Stimoli sussultare sono rumori comunemente bianco di 20 ms di durata e tempi di salita molto ripido (0, se possibile). L'intensità è idealmente al volume in cui la funzione I / O raggiunto il plateau di massima risposte di allarme, comunemente a 105-115 dB. Gli intervalli tra le prove unico dovrebbe essere sempre 20 secondi o randomizzati tra 10 e 30 secondi (vedi la discussione e la figura 3). Block II prepulse inibizione: Al fine di misurare PPI, le prove con un impulso trasalimento sola e delle sperimentazioni prepulse sono pseudorandomized nel blocco II. Rumore di fondo e stimolo spaventare sono le stesse in blocco I. Il prepulse è un rumore bianco di 4 ms di durata e tempo di salita ripida. Due parametri possono essere svariati: l'intervallo tra interstimulus prepulse e sussultare impulso e l'intensità del prepulse (vedi discussione). Noi proponiamo di utilizzare comunemente due diversi prepulse intensità (75 e 85 dB) e due diversi intervalli di interstimulus (30 ms e 100 ms). Così ci sono quattro diversi prepulse impulsi prove più l'impulso di trasalimento solo prove da pseudorandomized e visualizzati 10 volte ciascuno, che ammonta a 50 prove. Inter-trial intervalli possono essere 20 secondi o randomizzati tra 10 e 30 secondi (vedi discussione). In alcuni casi potrebbe essere utile per aggiungere un sesto tipo di prove, che è un prepulse sola prova (vedi la discussione e figura 4). A lungo termine assuefazione: Al fine di misurare LTH, l'intero protocollo viene eseguito su almeno cinque giorni successivi. In alternativa, solo la fase di acclimatazione e bloccare avrei potuto essere eseguito, invece, per vedere LTH, blocco mi deve contenere almeno 100 sussultare stimoli. La presentazione di 30 stimoli al giorno porta a LTH molto poco o niente nella maggior parte dei animali, soprattutto nei topi. Funziona dovrebbe essere circa alla stessa ora di ogni giorno, dal momento che ampiezze risposte di allarme fluttuare con il ciclo diurno. 2. Manipolazione e acclimatazione degli animali Ci sono grandi differenze nel trattamento e acclimatazione di ratti contro topi. I topi verranno inseriti nel supporto animale adatto (che non deve essere vincolato) per 2-5 minuti con il rumore di fondo ma senza stimoli trasalimento (fase di acclimatazione del programma). Questa procedura deve essere ripetuta 3-5 volte, una o due volte al giorno, fino a quando la defecazione e la minzione nel supporto del mouse cessa o si riduce notevolmente. Detentori degli animali devono essere sempre sostituito o pulito dopo un animale è stato rimosso. I ratti devono essere trattati per almeno tre sessioni di 17. Al termine delle sessioni di trattamento terzo sono inseriti in un supporto adeguate sugli animali (senza frenare) ed esposti al rumore di fondo per diversi minuti. Dopo averli rimossi, possono essere premiati con semi di girasole al fine di formare passociazioni ositive la procedura di test. Questa procedura viene ripetuta altre due volte, via via ampliando il tempo di acclimatazione, prima che l'intero protocollo viene eseguito. Per le sessioni di test, gli animali sono inseriti in tutte le camere, porte chiuse e il protocollo con la fase di acclimatazione, mi blocco e blocco II viene eseguito. Se ci sono diversi gruppi di animali (iniezioni, genotipi), che deve essere miscelato o randomizzati su diverse prove e nelle varie caselle. Se un animale viene ripetutamente testato (ad esempio con trattamenti diversi), dovrebbe essere nuovamente testati nella stessa scatola. Per ripetuti test PPI nei ratti, si consiglia inoltre di eseguire un intero protocollo prima della raccolta effettiva dei dati avviene. PPI spesso migliora tra la prima e la seconda sessione di test (PPI apprendimento), e si mantiene invariata dopo. Sarà anche di eliminare una bella fetta di LTH. 3. Analisi dei dati A breve termine assuefazione: a breve termine l'analisi assuefazione, tutte le risposte spavento di blocco mi sono tracciate per ogni animale. Se gli animali all'interno di un gruppo sono simili ampiezze risposte di allarme, i valori possono essere mediate tra animali. Nella maggior parte dei casi, tuttavia, assoluto ampiezze sussultare variano considerevolmente tra gli animali e livelli di spaventare non sono normalmente distribuiti. In questo caso è più praticabile per normalizzare i dati di ogni animale per il suo primo, o la media dei primi due, le risposte startle nel blocco di I (animali a volte cadono addormentati durante la fase di acclimatazione con conseguente scarsa risposta startle primo ed un alto sussultare secondo). I dati normalizzati possono quindi essere calcolate come media tra tutti gli animali al fine di tracciare la rotta di assuefazione. Per una valutazione quantitativa della quantità di assuefazione, un punteggio può essere calcolato per ogni animale, ad esempio, la media degli ultimi 10 risposte spavento diviso per la media dei primi due risposte (figura 6). Prepulse inibizione: per analizzare prepulse inibizione, i dati del blocco II deve essere ordinato in base al tipo di prova (ad esempio, esportando tutte le colonne di dati rilevanti in excel e ordinare prepulse intensità e la durata di ISI). Le dieci tracce per tipo di prova sono poi media, ei valori che ne derivano per la prepulse impulsi prove sono divisi per l'impulso di trasalimento solo valore e moltiplicato per 100. Questo rivela la quantità di startle restante (in percentuale del valore basale trasalimento) in diverse condizioni prepulse per ogni animale. Baseline startle (impulso da solo) è al 100%. Questi valori possono essere mediati attraverso gli animali di un gruppo e di essere rappresentati (figura 7a). In alternativa, la quantità di PPI può essere tracciata sottraendo la risposta rimanenti trasalimento dal 100% (figura 7b). Attenzione: quando si confrontano PPI in diversi gruppi di animali, è sempre necessario anche segnalare se c'è una differenza in base ampiezze trasalimento, per esempio confrontando le ampiezze sussultare assoluto dell'impulso di trasalimento prove da solo (o ampiezze sobbalzare nel blocco I) . A lungo termine assuefazione: Al fine di analizzare LTH le prime due risposte di blocco che di ogni giorno sono in media e tracciati sopra il minimo di cinque sessioni di test consecutivi. Questo elimina la possibilità che le differenze di STH influenzare il risultato delle analisi LTH. Se è stato stabilito che un gene trattamento / non influisce STH, in alternativa tutte le risposte in blocco posso essere semplicemente una media per ogni giorno ed essere tracciati. LTH può essere quantificato attraverso il calcolo di un punteggio assuefazione dove 'è diviso valore nei primi giorni' gli ultimi giorni e valore moltiplicato per 100, in modo che la percentuale di livello trasalimento iniziale che rimane dopo LTH viene visualizzato. Punteggi assuefazione può poi essere mediati attraverso animali (figura 8). 4. Rappresentante dei risultati: i / o funzione: Roditore tipicamente iniziano a spaventare da un volume di 85-90 dB (con 20 ms di durata, rumore bianco). Le risposte di allarme aumenta con l'aumento di volume e raggiunge normalmente un massimo a 100-110 dB. Se gli animali si discostano molto da questi valori, gli animali potrebbero avere interrotto capacità uditive o abilità motorie. Tipiche funzioni I / O sono visualizzati in figura 5. A breve termine assuefazione: Beh ratti trattati normalmente abituarsi a circa il 60% delle loro risposte di allarme iniziale, ma ci sono enormi differenze individuali e anche delle differenze di deformazione. L'effetto più forte assuefazione avviene normalmente entro il primo stimoli diversi. I topi hanno generalmente abituare a meno di topi (tipicamente a circa il 80%), ma differenze di ceppi possono essere molto grandi. Un corso di assuefazione tipica è mostrata in figura 6. Prepulse inibizione: la maggior parte ratto mostrano PPI di circa il 90% con un ottimo prepulse (85dB, 4 ms, rumore bianco). PPI è molto robusto e le differenze individuali sono relativamente piccole con queste impostazioni sperimentali. Prepulses volume più bassoresa meno PPI e una maggiore variabilità (anche all'interno di un animale), ma sembra anche essere più vulnerabili alle manipolazioni farmacologiche o genetiche. Diversi risultati PPI sono tracciati in figura 7. A lungo termine assuefazione: a lungo termine assuefazione può essere osservato per le sessioni di test diversi. LTH è molto robusto nei ratti. Nei topi, che spesso richiede la presentazione di un sacco di stimoli sussultare in ogni sessione per osservare LTH. Tipico risultati LTH può essere visto in figura 8. Figura 1. Protocollo di stimolo per le funzioni di I / O. Dopo un periodo di acclimatazione di 5-10 min. con 65 dB il livello di pressione sonora (SPL) rumore di fondo e senza stimoli trasalimento (non mostrato), 20 ms stimoli rumore bianco vengono presentati ogni 20 secondi. L'intensità aumenta gradualmente dal 75-130 dB con incrementi di 5 dB (bg = rumore di fondo). Figura 2. Struttura Protocollo per assuefazione combinato e la misurazione PPI. Durante l'intero protocollo, un rumore di fondo continuo di 65 dB si applica. C'è un periodo di acclimatazione di 5-10 min. senza alcuna stimolazione ulteriore. Subito dopo, l'abitudine è testato da 30-100 stimoli trasalimento (blocco io, vedi figura 3). Questo è immediatamente seguita da PPI test (blocco II, vedi figura 4). Figura 3. Protocollo di stimolo per la misurazione assuefazione (blocco I). Un esempio per un blocco tipico io per il test a breve termine abitudine viene mostrato. Si compone di 30 100 prove identiche, dove viene presentato un ms 20 105 dB di rumore bianco con un tempo 0 con un aumento inter-trial intervallo (ITI) di 20 sec. Variazioni di questo protocollo può includere una più elevata intensità di stimolo sorprenda e ITI variabile Figura 4. Protocollo di stimolo per la misurazione PPI (blocco II). Un esempio per una parte II, tipiche di un blocco per i test PPI è mostrato. Block II è composto di 5-6 tipi diversi di prova che vengono presentati 10 volte in un ordine pseudorandomized. Qui, due diversi prepulse intensità (75 dB e 85 dB) e due diversi intervalli di interstimulus (ISIS, 30 e 100 ms) vengono testati. Stimolo sussultare solo prove e prepulse solo prove si alternano. Questo blocco avrebbe 6×10 = 60 prove. Prepulses sono 4 ms impulsi di rumore bianco con 0 tempo di salita. Variazioni di questo protocollo consisterebbe nel ITI variabile, più alta intensità di stimolo sussultare, prepulse diversa intensità e / o durata, e Iside diverse tra prepulse e polso. Figura 5. Esempio per un i / o funzione. L'ingresso / uscita delle curve di 11 topi individuale dello stesso ceppo vengono visualizzati in grigio. In questo caso, le ampiezze trasalimento individuali variano notevolmente (startle risposte sono in unità arbitrarie). La linea nera mostra le ampiezze media trasalimento e gli errori standard a diverse intensità di stimolo sussultare. Questi topi hanno raggiunto il loro massimo di risposta trasalimento a circa 105 dB. Figura 6. Esempio di breve termine dati assuefazione. Un tipico media a breve termine della curva assuefazione di 20 topi è mostrato. Ampiezze sussultare di ogni topo in risposta a stimoli sussultare 30 sono stati normalizzati per la media dei suoi primi due risposte spavento negli studi 1 e 2. I dati normalizzati è stata quindi calcolata la media tra topi e l'errore standard è stato calcolato. Figura 7 Esempio di dati PPI A:.. Media di dati PPI di 8 topi è mostrato. Le 10 prove sussultare solo del blocco II sono stati in media per ogni mouse e le medie dei tipi di prova altre espresso come percentuale dello stimolo da solo ampiezze sussultare. La figura mostra l'ampiezza risposte di allarme in diverse prepulse condizioni. Due diverse ISIS (30 e 100 ms) e di due diversi prepulse intensità (75 e 85 dB) sono stati misurati. B: stessi dati in A, ma rappresentati come quantità di PPI in percentuale del trasalimento basale. I dati riportati sopra è stato sottratto da 100. Questi topi hanno mostrato un PPI massimo del 50% circa. Si prega di notare che lo stesso protocollo resa PPI nella maggior parte dei ceppi di topi di circa il 90%. Figura 8 Esempio di dati a lungo termine assuefazione A:.. Media di dati LTH per 18 topi è mostrato. Tha due prime risposte soprassalto nel blocco di ogni giorno mi erano media in tutti i topi. Le barre relativamente grande errore standard sono principalmente causate dalle differenze in valore assoluto ampiezza trasalimento tra singoli topi. B: normalizzato ampiezze sussultare di 18 topi in cinque giorni. Al fine di ridurre il rumore, gruppi da 6 risposte consecutivi soprassalto nel blocco I (30 stimoli) sono stati sempre in media per animale, con conseguente blocco per cinque valori che per ogni animale al giorno. Questi sono stati normalizzati per ciascun animale il primo valore del primo giorno (100%). La media su tutti i 18 animali viene visualizzato. Essa mostra STH all'interno di ogni giorno, così come LTH in cinque giorni.