Gewenning en prepulse Remming van akoestische schrikreactie bij knaagdieren

1. Ontwerp-protocol Kalibratie: Voordat een reeks experimenten, kalibreren van de luidsprekers. Dit is belangrijk, zodat luidspreker de exacte hoeveelheid die is ingesteld door de experimentator. Ook kalibreren van de gevoeligheid van de transducer platform van de schrikreactie dozen volgens de leverancier van de handleiding. De transducer zet de verticale beweging van het platform in een spanningssignaal. Zorg ervoor dat er geen lopende experimenten bij het kalibreren van het systeem, en dat alle dozen zijn gekalibreerd op dezelfde manier. i / o-functie: Als er nieuwe stammen van muizen of ratten worden gemeten, een input / output-functie dient te worden vastgesteld. Na een acclimatiseringsperiode van 5-10 minuten met een constante achtergrond witte ruis van 65 tot 68 dB (zie hieronder), moeten schrikken stimuli (20 ms witte ruis) worden weergegeven om de 20 sec, te beginnen bij ongeveer 70-75 dB. Schrikreacties stimulus intensiteit zal worden verhoogd tussen elke stimulus met 2-5 dB tot het bereiken van 120 tot 130 dB, wat resulteert in 10-30 studies met schrikken stimuli (zie figuur 1). Protocol structuur: Gewenning en prepulse remming kan worden gemeten binnen een protocol. Het protocol is onderverdeeld in een acclimatiseringsperiode, een blok I (gewenning), onmiddellijk gevolgd door een blok II (PPI, figuur 2). Voor het meten van prepulse remming, moeten de dieren altijd ondergaan schrikken gewenning, zodat schrikken verzwakkerstanden als gevolg van gewenning niet interfereren met PPI metingen. Acclimatiseringsperiode: Elke keer dat een dier wordt getest, het eerst ondergaat een acclimatisatie fase in om aan te passen aan het dier houder, schrikken doos en achtergrondgeluiden. Tijdens een 5-10 minuten acclimatiseringsperiode, het constante achtergrondgeluid van 65-68dB witte ruis (afhankelijk van het geluid van het milieu) wordt weergegeven, maar geen schrik stimuli. Tijdens deze fase zal het dier te kalmeren, stoppen om de omgeving te verkennen en stoppen met bewegen. Blok I gewenning: Voor de korte termijn gewenning (STH), tussen 30 -100 schrikken prikkels moet worden toegepast op de achtergrond. Schrikreacties stimuli worden over het algemeen wit geluiden van 20 ms duur en zeer forse stijging keer (0, indien mogelijk). De intensiteit is idealiter op het volume waar de i / o-functie bereikt het plateau van de maximale schrikreactie, die gewoonlijk op 105 tot 115 dB. De intervallen tussen enkele proeven moeten ofwel altijd 20 sec of gerandomiseerd tussen 10 en 30 sec (zie bespreking en figuur 3). Block II prepulse remming: Om de PPI, processen te meten met een schrikreactie puls alleen tests en proeven met een prepulse zijn pseudorandomized in blok II. Achtergrondruis en schrikken stimulans zijn dezelfde als in blok I. De prepulse is een witte ruis van 4 ms duur en ook de sterke stijging van de tijd. Twee parameters kunnen worden gevarieerd: de interstimulus interval tussen prepulse en schrikken pols en de intensiteit van de prepulse (zie discussie). We stellen voor om het algemeen gebruik van twee verschillende prepulse intensiteiten (75 en 85 dB) en twee verschillende interstimulus intervallen (30 ms en 100 ms). Zo zijn er vier verschillende prepulse-puls proeven plus de schrikreactie puls alleen proeven die worden pseudorandomized en weergegeven 10 keer per stuk, waarvan 50 trials totalen. Inter-trial intervallen kan 20 sec of gerandomiseerd worden tussen 10 en 30 sec (zie bespreking). In sommige gevallen kan het nuttig een zesde soort processen, dat is een prepulse alleen trial (zie bespreking en figuur 4) toe te voegen. Lange-termijn gewenning: Om LTH te meten, de gehele protocol wordt uitgevoerd op ten minste vijf opeenvolgende dagen. U kunt ook alleen de acclimatisatie fase en block ik kon worden uitgevoerd, echter, om te LTH te zien, te blokkeren zou ik in ieder geval schrikken 100 stimuli bevatten. De presentatie van 30 stimuli per dag leidt tot zeer weinig of geen LTH bij de meeste dieren, met name bij muizen. Werkt moet worden op ongeveer dezelfde tijd van elke dag, omdat schrikreactie amplitudes fluctueren met de dagelijkse cyclus. 2. Hantering en Acclimatisering van dieren Er zijn grote verschillen in de behandeling en de acclimatisering van ratten versus muizen. Muizen zal worden geplaatst in de juiste dier houder (deze mag niet worden belemmerd) voor 2-5 minuten met achtergrondgeluiden, maar geen schrikken prikkels (acclimatisatie fase van het programma). Deze procedure moet worden herhaald 3-5 keer, of twee keer per dag, tot ontlasting en urine in de muis houder niet langer of aanzienlijk afneemt. Dier houders moeten altijd worden vervangen of schoongemaakt na een dier is verwijderd. Ratten moeten worden behandeld gedurende minstens drie sessies 17. Aan het eind van de derde behandeling sessies ze zijn geplaatst in een geschikte houder van dieren (geen bedwingen) en blootgesteld aan achtergrondruis voor enkele minuten. Na het verwijderen van hen, kunnen ze worden beloond met zonnebloempitten om te vormen pOSITIEVE associaties met de testprocedure. Deze procedure wordt herhaald twee keer, geleidelijk aan het uitbreiden van de acclimatisering tijd, voordat het gehele protocol wordt uitgevoerd. Voor het testen van sessies, dieren zijn geplaatst in alle kamers, deuren gesloten en het protocol met de acclimatisering fase, blok I en blok II wordt uitgevoerd. Als er verschillende groepen van dieren (injecties, genotypen), moeten ze vermengd of gerandomiseerd worden over de verschillende pistes en van de verschillende dozen. Als een dier wordt meerdere malen getest (bijvoorbeeld met verschillende behandelingen), moet het opnieuw worden getest in dezelfde box. Voor herhaalde PPI testen in ratten, wij raden ook aan om een ​​heel protocol uitgevoerd voordat de feitelijke dataverzameling plaatsvindt. PPI verbetert vaak tussen de eerste en de tweede testsessie (PPI leren), en blijft consistent daarna. Het zal tevens een einde aan een groot deel van LTH. 3. Data Analysis Korte termijn gewenning: Voor de korte termijn gewenning analyse, alle schrikreacties van blok I worden uitgezet voor elk dier. Als dieren in een groep hebben vergelijkbare schrikreactie amplitudes, kunnen de waarden worden gemiddeld tussen de dieren. In de meeste gevallen echter, absolute schrikken amplitudes verschillen aanzienlijk tussen de dieren en schrikken niveaus zijn niet normaal verdeeld zijn. In dit geval is het meer rendabel om de gegevens van elk dier normaliseren haar eerste, of het gemiddelde van de eerste twee, schrikreacties in blok I (dieren soms in slaap vallen tijdens het acclimatiseren fase resulteert in een lage eerste schrikreactie en een hoge seconden schrik). De genormaliseerde gegevens kunnen vervolgens worden gemiddeld over alle dieren in om de loop van gewenning plot. Voor een kwantitatieve beoordeling van het bedrag van gewenning, kan een score worden berekend voor elk dier, het gemiddelde van de laatste 10 schrikreacties gedeeld door het gemiddelde van de eerste twee reacties (figuur 6) bijvoorbeeld. Prepulse remming: Voor het analyseren van prepulse inhibitie, de gegevens van blok II dient te worden gesorteerd op basis van de aard van de studie (bijvoorbeeld door de uitvoer van alle relevante gegevens kolommen in Excel en sorteren prepulse intensiteit en de duur van de ISI). De tien sporen per soort onderzoek worden dan gemiddeld, en de resulterende waarden voor de prepulse-puls studies worden gedeeld door de schrikreactie pols alleen waarde en vermenigvuldigd met 100. Dit onthult de hoeveelheid resterende schrikken (in procent van de baseline schrik) onder verschillende omstandigheden prepulse voor elk dier. Baseline schrikken (puls alleen) is 100%. Deze waarden kunnen vervolgens worden gemiddeld over dieren van een groep en worden uitgezet (figuur 7a). Als alternatief kan het bedrag van de PPI worden uitgezet door het aftrekken van de resterende schrikreactie van 100% (figuur 7b). Let op: als je PPI vergelijken in verschillende groepen van dieren, moet u ook altijd melden of er een verschil in baseline schrik amplitudes, door bijvoorbeeld het vergelijken van de absolute schrikken amplitudes van de schrikreactie puls alleen proeven (of schrik amplitudes in blok I) . Lange-termijn gewenning: Om te analyseren LTH de eerste twee reacties van blok I van elke dag worden gemiddeld en uitgezet op het minimum van vijf opeenvolgende testsessies. Dit elimineert de mogelijkheid dat de verschillen in STH het resultaat van de LTV analyse beïnvloeden. Indien is vastgesteld dat een behandeling / gene niet STH, als alternatief alle antwoorden van invloed zijn in blok I kan eenvoudig worden gemiddeld voor elke dag en worden uitgezet. LTH kan worden gekwantificeerd door berekening van een gewenning score waar de laatste dagen 'waarde wordt gedeeld door de eerste dag' waarde en vermenigvuldigd met 100, zodat het percentage van de aanvankelijke schrik niveau overblijft na LTH wordt weergegeven. Gewenning scores kunnen vervolgens worden gemiddeld over dieren (figuur 8). 4. Representatieve resultaten: i / o-functie: Knaagdieren beginnen meestal om van een volume van 85-90 dB schrikken op (met 20 ms duur, witte ruis). De schrikreacties neemt toe met toenemende volume en normaal bereikt een maximum bij 100 tot 110 dB. Als dieren aanzienlijk afwijken van deze waarden, kunnen dieren verstoord gehoor gaven of motoriek. Typische i / o-functies worden weergegeven in figuur 5. Korte termijn gewenning: Nou behandeld ratten normaal wennen aan ongeveer 60% van hun aanvankelijke schrikreactie, maar er zijn grote individuele verschillen en ook de stam verschillen. Het sterkste effect treedt gewenning gewoonlijk binnen de eerste paar stimuli. Muizen hebben over het algemeen wennen minder dan ratten (meestal tot ongeveer 80%), maar stam verschillen kunnen zeer groot zijn. Een typische gewenning cursus is weergegeven in figuur 6. Prepulse inhibitie: De meeste ratten blijkt PPI van rond de 90% met een optimale prepulse (85dB, 4 ms, witte ruis). PPI is zeer robuust en individuele verschillen zijn relatief klein met deze experimentele instellingen. Lager volume prepulsesopbrengst minder PPI en meer variabiliteit (zelfs binnen een dier), maar ook lijkt te zijn meer kwetsbaar voor farmacologische of genetische manipulaties. Verschillende PPI resultaten zijn weergegeven in figuur 7. Lange-termijn gewenning: Lange termijn gewenning kan worden waargenomen over meerdere testsessies. LTH is zeer robuust bij ratten. Bij muizen, vereist het vaak de presentatie van een veel schrik stimuli in elke sessie om LTH observeren. Typische LTH resultaten zijn te zien in figuur 8. Figuur 1. Stimulus protocol voor i / o-functie. Na een acclimatiseringsperiode van 5-10 minuten. met 65 dB geluidsdruk (SPL) achtergrondgeluid en geen schrikken stimuli (niet afgebeeld), zijn 20 ms witte ruis stimuli gepresenteerd om de 20 sec. De intensiteit neemt geleidelijk 75 tot 130 dB in stappen van 5 dB (bg = achtergrondgeluid). Figuur 2. Protocol structuur voor gecombineerde gewenning en PPI meting. Gedurende het hele protocol, is een constante ruis van 65 dB toegepast. Er is een acclimatiseringsperiode van 5-10 minuten. zonder verdere stimulatie. Onmiddellijk daarna, wordt getest door gewenning 30-100 schrikken stimuli (blok I, zie figuur 3). Dit wordt onmiddellijk gevolgd door het testen van PPI (blok II, zie figuur 4). Figuur 3. Stimulus-protocol voor het meten van gewenning (blok I). Een voorbeeld van een typische block ik voor het testen van de korte termijn gewenning wordt getoond. Het bestaat uit 30 identieke 100 studies, waarbij een 20 ms 105 dB witte ruis met een 0 stijgtijd wordt gepresenteerd met een inter-trial interval (ITI) van 20 sec. Variaties van dit protocol kan een hogere schrikken stimulus intensiteit of variabele ITIS Figuur 4. Stimulus-protocol voor het meten van PPI (blok II). Een voorbeeld van een typisch onderdeel van een blok II voor het testen van PPI wordt weergegeven. Blok II bestaat van 5-6 verschillende trial types die 10 maal elk worden gepresenteerd in een pseudorandomized volgorde. Hier worden twee verschillende prepulse intensiteiten (75 dB en 85 dB) en twee verschillende interstimulus intervallen (Isis, 30 en 100 ms) getest. Schrikreacties stimulus alleen proeven en prepulse alleen proeven worden afgewisseld. Dit blok zou 6×10 = 60 studies. Prepulses zijn 4 ms white noise pulsen met 0 stijgtijd. Variaties van dit protocol zou bestaan ​​in variabele ITIS, hogere schrikken stimulus intensiteit, verschillende prepulse intensiteiten en / of duur, en verschillende ISIS tussen prepulse en pols. Figuur 5. Voorbeeld voor een i / o-functie. De input / output curven van 11 individuele muizen van dezelfde stam worden weergegeven in het grijs. In dit geval moeten de individuele schrikken amplitudes verschillen aanzienlijk (schrikreacties zijn in willekeurige eenheden). De massieve zwarte lijn geeft het gemiddelde schrikken amplitudes en standaard fouten bij verschillende schrikken stimulus intensiteit. Deze muizen bereikten hun maximale schrikreactie rond de 105 dB. Figuur 6. Voorbeeld voor de korte termijn gewenning data. Een typische gemiddelde op korte termijn gewenning curve van 20 muizen wordt getoond. Schrikreacties amplitudes van elke muis in reactie op 30 schrikreactie stimuli werden genormaliseerd om het gemiddelde van de eerste twee schrikreacties in proeven 1 & 2. De genormaliseerde gegevens werden vervolgens gemiddeld over muizen en de standaardfout is berekend. Figuur 7 Voorbeeld voor PPI gegevens A:.. Gemiddeld PPI gegevens van 8 muizen wordt getoond. De 10 schrik alleen al proeven van Blok II waren gemiddeld voor elke muis en de gemiddelden van de andere proef types uitgedrukt als het percentage van de stimulus alleen al schrikken amplitudes. De figuur toont de schrikreactie amplitudes onder verschillende prepulse omstandigheden. Twee verschillende ISIS (30 en 100 ms) en twee verschillende prepulse intensiteiten (75 en 85 dB) gemeten. B: dezelfde gegevens als in A, maar uitgezet als hoeveelheid PPI in procent van de baseline schrikken. De gegevens hierboven weergegeven werd afgetrokken van 100. Deze muizen bleek een maximum PPI van ongeveer 50%. Houdt u er rekening mee dat het hetzelfde protocol PPI opbrengst in de meeste ratten stammen van rond de 90%. Figuur 8 Voorbeeld voor de lange termijn gewenning gegevens A:.. Gemiddeld LTH gegevens voor 18 muizen wordt weergegeven. Thij voor het eerst twee schrikreacties in blok I van elke dag werden gemiddeld over alle muizen. De relatief grote standaardfout bars worden vooral veroorzaakt door verschillen in absolute schrik amplitude tussen individuele muizen. B: De genormaliseerde schrikken amplitudes van de 18 muizen over vijf dagen. Om de geluidsoverlast te verminderen, werden groepen van 6 opeenvolgende schrikreacties in blok I (30 stimuli) altijd gemiddeld per dier, wat resulteert in vijf waarden voor blok I voor elk dier per dag. Deze werden genormaliseerd voor elk dier de eerste waarde van de eerste dag (100%). Het gemiddelde over alle 18 dieren wordt getoond. Het toont STH binnen elke dag, evenals LTH over vijf dagen.