層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

1。内皮前駆細胞の分離前の末梢ヒト血液中の任意のコレクションに、あなたの治験審査委員会（IRB）にあなたの研究プロトコルを提出し、その承認の後、ボランティアのドナーのインフォームドコンセント（末梢血のコレクションとEPC単離はデューク大学のIRBによって承認されていた入手し、 ）ヒトの研究の参加者の保護に関連する米国の規制要件に完全に準拠しています。 動物由来のEPCを操作するとき、あなたの研究のプロトコールは、動物実験の認可を受けなければと委員会（IACUC）を使用してください。すべての私達のブタの実験は、デューク大学のIACUCによって承認されていたと人道的なケアの最高基準に準拠して実施された。 内皮前駆細胞の分離には、抗凝固citratで満たされた採血バッグに同意のボランティアドナーからの標準的な瀉血技術を介して末梢血50mlを集めるEリン酸デキストロースとはハンクのバッファ塩溶液と1:1（のCaCl 2、MgCl 2を 、MgSO 4を除く）とHistopaqueの同じボリューム上に層が明確に定義されたレイヤーを作成するためのソリューションを希釈する。 遠心分離（30分、740グラム、低ブレークの設定）および単核細胞（MNC）（バフィーコート）層を収集する。再懸濁し、ダルベッコのリン酸で洗浄多国籍企業× 3は、（MCDB – 131培地5のフルEPC増殖培地で2つの12ウェルプレートにプレーティングする前に、10％ウシ胎児血清（FBS）× 10分、515グラムで（DPBS）緩衝生理食塩水37 200mMのL -グルタミン、10％FBSとEGM – 2 SingleQuots）のml ° C、5％CO 2。 ゆっくりして最初の7日間、一日おきに24時間ごとに培地交換。 EPCのコロニーは、その石畳の形態に基づいて、14日間の平均時間の後に識別することができます。かつて12ウェル表面積の文化のカバー¼のEPCは、セルを展開し、表面マーカーの存在をテストすることによって、フローサイトメトリーによるEPCのアイデンティティを確認するCD31と、以前に6を説明するようにCD14、CD45の欠如。実行することができる他のアッセイは、DII – AC – LDLによる細胞の形態とラベルが含まれています。 実験では、本明細書に記載のために彼らは37℃加湿インキュベーター中、EPC培地中で3 T – 75細胞培養フラスコでほぼコンフルエントになるまで、隔離されたEPCを拡大° C、5％CO 2。 2。せん断応力計算我々は、これらの計算が達成できる条件を十分に理解を持っているチャンバーとチャネルを製造する前に実行されることをお勧めします。希望のせん断に基づいて、回路内の灌流液の流量は、式1にしたがって細胞に適用する応力を計算する Qは、所望の流量である、τは、ターゲットのです。細胞の接線方向に働く応力を聞く、wはフローチャンバーの幅、hはフローチャンバーの高さであり、μは灌流液の粘度（流動媒体）です。 使用される媒体の粘度の標準値（μ）0.9 CP（0.009グラムcm -1の秒-1）です。粘度もので、7を必要に応じて、高分子量デキストランを使用することによって発生する可能性があることに注意してください。ターゲットのせん断応力の典型的な値（τ）は、上記生理的なせん断応力を希望する場合は、15ダイン/ cm 2、（典型的な動脈せん断応力）または100ダイン/ cm 2である使用。 267μmの-私たちの部屋は、通常、166の範囲では1.9センチ、高さ（H）の幅（w）を持っています。 3。フローチャンバーの製造目の上部と底板をカット7 × 2 × 0.5"7 × 2 × 0.25のと底部の寸法"の最上位のディメンションを持つアルミニウム合金6061長方形の在庫からの電子チャンバー。 1.375"（幅）× 0.3125"深い流体貯留のためのエンドごとに"0.950を残して深い、"0.125〜凹部中央部にトッププレートを。 下側から1 / 16"（幅）× 0.625"長いスロットが流入し、流出端の貯水池に侵入するために穴を開けます。 各トッププレートの最後に、流体リザーバを貫通してホース中心部に位置する32分の10"ポリプロピレン1 / 8インチあたりのトラック数（TPI）の穴を"ドリル。流入側では、ホース口"ポリプロピレン1 / 8穴を通してTPI"32分の10とサイドのプラグインを作成。 テーパー流体流入からの流体の十分な混合のための0.518度でウィンドウを表示してガラスに底面、上面。 上部表示窓に沿って、底板にガラスのスライド窓をカット。チャンバー内に水族館のセメント、接着剤、ガラスのスライドを使用する。少なくとも24時間は治療することができます。表示窓が75 × 25 × 1mmの顕微鏡のスライドガラスは、チャンバー内のフラッシュ座っれるように凹んでいることを確認してください。 "彼らは0.02離隔されるように、上部と下部プレートの下面の周囲にO -リングのための凹部を作成します。ゴム製O -リングを挿入します。 平頭ねじ10に一致する32分の8"8 / 32で使用するための上部および下部チャンバーのTPIの穴"をあけます。 4。流回路アセンブリ第一全体の流れの回路を組み立てる、その殺菌に進みます。 "（接続パルスダンパー8分の1を経由）の一端にハードチューブのセグメント36"を取り付けます。もう一方の端に、ソフトチューブの18"セグメントを添付する。 ステップ4.2で述べたようにソフトチューブのセクション1 / 8"18の端にはオス型ルアーアダプター"を、置きます。 1 / 8オスルアーを接続する"メスルアーアダプター。新しい18にメスルアーを添付"セグメントソフトチューブ。 チューブを収めるために、250mlのガラスビーカーのキャップに3つの穴を開けます。 I250mlガラスボトル（タンクなど）（ 図2）にキャップの他の2つの穴に通しつの穴とハードとソフトチューブの自由端部にソフトチューブの1.5"セグメントを（換気口など）nsert。ハードチューブはタンクの底を（貯水池からの流出のチューブなど）に達することを確認してください。 121℃蒸気オートクレーブによる上記部品を滅菌℃で60分間。さらに"× 5 / 16、6"8から32までのフラットヘッドネジ、ピンセット1組つの完全なフローチャンバーをオートクレーブ、3 × 2"ソフトチューブのセグメント、男性1と1 / 8メス"ルアーアダプター、4 × ½一75 × 25 × 1mmのガラススライド（または他の所望の細胞の表面材）、および2外科タオル。 層流フード内に滅菌タオルを置きます。この滅菌野に流れ回路、フローチャンバー、4 × 4ウェイストップコック、1 × 1方活栓、およびステップ4.5からすべて滅菌部品を置きます。 今すぐ2つの4ウェイストップコックを接続するための滅菌手袋を使用してください。オープンサンプルポートにキャップを置きます。 </li> 流回路の2つのソフトチューブのセグメントを接続する雄と雌のルアーアダプターを外し、接続されている三方活栓（ 図3）を挿入する。 30mlの注射器にリザーバーに挿入された柔らかいチューブを取り付け、注射器のピストンを取り外します。 EPC培地（ 図4）125mlの瓶に詰める。 通気孔（ 図4）に滅菌シリンジフィルターを置きます。 37℃加湿インキュベーター中に流路を移動° C、5％CO 2。 チューブのこのタイプ（ 図5）で使用するために示されているローラーポンプヘッドにハードチューブをクランプする。チューブはトラックをマウントローラーポンプとオーバーラップしていないことを確認してください。ここで、それが終了するマーキングペンでいずれかの側のポンプヘッドをチューブにマークを付けます。 すべてのストップコックはサンプルポートに向かって閉ざされていることを確認し、流路に沿って開きます。ポンプを起動します。流れの方向を確認してください。灌流液は、frを移動してくださいOM、パルスダンパーにハードチューブを通してガラスの貯水池。 5。 EPC蛍光標識 37に流れ回路が温まるには° C、スライド上にシードするためにセルを準備しながら。細胞が不透明な材料、例えばチタン（Ti）で視覚化されるかどうか蛍光標識が必要であることに注意してください。 ジメチルスルホキシド（DMSO）の90μlを50μgのCTO粉末を希釈することによりセルトラッカーオレンジ（CTO）の1 mMのストック溶液を作成します。光照射（流フードの下で働いている間ライトをオフにする）から、この混合物を保護してください。 無血清MCDB – 131培地18 mlにCTOのストック溶液36μlを希釈してCTOの2μMのワーキングソリューションを作成します。 10ミリリットルDPBS（カルシウムまたはマグネシウムなし）でコンフルエントT – 75細胞培養フラスコに近い3にEPCをすすいでください。 各フラスコに2μMCTOワーキング溶液6mlを追加。 37℃で15分間インキュベート℃に10mlのDPBS（カルシウムまたはマグネシウムなし）を各フラスコ× 2をすすぐ。 <l私は>各フラスコにトリプシン4mlを追加。 37℃を3分間。トリプシン中和溶液8 mlを中和する。 EPC培地5mlで600グラムを再懸濁しますで遠心分離× 5分で洗浄する。 6。チャンバーアセンブリを流す前に、スライドの細胞播種ガラス、チタン、または他の材料で作られたスライドを使用することができます、そしてスライドの表面は、ポリマーをスピンコーティングによって変更または金属の層を追加することができます。滅菌長方形の四室の細胞培養容器（またはポリスチレン表面が所望される場合、組織培養スライドのフラスコを使用）にスライドを置きます。コンフルエントな細胞層がフローの開始（ 図11A）で希望する場合はEPC培地× 6時間の5mlにスライド上に細胞や種子1.5 × 10 6細胞を数える。 流体せん断応力下で細胞拡散と接着性を試験するためには、3 × 10 6細胞は、フローの開始（クイック播種）の前にわずか15分間付着することができます（ <strong>図。 11B）。 7。フローチャンバーアセンブリ滅菌手袋を使用して、メス型ルアーアダプター"1 / 8にソフトチューブのセグメント"1つの2を接続してください。オスルアーアダプター"1 / 8にソフトチューブのセグメント"別の2を接続してください。 "流入ポートにメスルアーアダプターとソフトチューブ2のアタッチ"2を添付する流出口にオスルアーと柔らかいチューブを。これらのルアーアダプターの両方に4ウェイストップコックを取り付けます。バブルトラップを抜け側のポートのコネクタに、残りの2"ソフトチューブの部分を接続し、1方活栓（ 図6）を添付してください。 滅菌ピンセットを用いて、細胞培養容器から細胞シードのスライドを（またはスライドのフラスコを使用している場合は、スライド上にフラスコを削除）削除し、フローチャンバーの底板にくぼみに置きます。スライドを上に向けて、セルシードの側に置かれていることを確認してください。 スライド上に暖かいEPC培地のピペットで10ミリリットル。培地は、スライドとフローチャンバー、BをカバーすることができますUTは、底板上にO -リングを介してメディアをこぼさないでください。 ネジ穴を合わせ、ボトムプレートにフローチャンバーの上部プレートを置きます。 2つのプレートが平行に保つことによって、このステップの間にチャンバー内に気泡を導入しないように注意してください。 一緒にネジのプレート（このプロセスまで自動バッテリ駆動ドライバーの速度）。 10mlのシリンジを使用してEPC培地で流入チューブをフラッシュ優しく流入側の気泡トラップのポートに接続し、1方活栓を開いて、流入気泡のトラップから気泡を取り除く。その後、（ 図7）このコックとキャップを締めます。 今再び10 mlの注射器を使用して、流出ポート4方活栓を開いて、ゆっくりとフローチャンバーを通じてEPC培地をフラッシュすることによりチャンバーのチャンネルから気泡を取り除く。大きな気泡が残っている場合、45 °の角度（ 図8）への室の流出側の端を上げる。 キャップ4方活栓の接続のすべてと密接なそれらのオフ。組み立てフローの回路（ 図9）とインキュベータにフローチャンバーを移動します。 流回路のポンプを一時停止します。漏れを防止し、チャンバーの内部が無菌に保つために流れの方向に流路のストップコックをオフに閉じてください。流回路に流フードからフローチャンバーを運んでください。流回路にフローチャンバーを接続します。流れの方向にストップコックを開きます。フローポンプを再開する。灌流液は、正しい方向に流れることを確認してください。希望のせん断応力に流量を調整します。 流動実験中に、フローチャンバーは、光や蛍光顕微鏡を介してイメージする回路からセルを削除することができます。そのためには、コック – コックの接続部で流路からのフローチャンバーを外してください。室の無菌性を維持するために、流れの方向に流れ回路のコックとフローチャンバーのコックをオフに閉じて、流れの回路を除去する前にすべてのストップコックにキャップを（ 図9）インキュベーターから。 8。灌流液のサンプルコレクション分析のための灌流液のサンプルを簡単に収集、（例えば、一酸化窒素の合成）、最初の休止ポンプ用。 パルスダンパーに一番近いコックを閉じます。その保護キャップを取り外し、サンプルポートに小型の注射器、例えば、3 mlの注射器を、挿入する。キャップを保持し、それが上下逆さまに置くことによって汚染されないことを確認してください。 パルスダンパー開放の方向にサンプルポートと回線を維持し、フローチャンバーの方向にコックを閉じます。 回路から、例えば、150μL、試料の所望量を描きます。シリンジを取り外す前に、サンプルポートに向かってコックをオフに閉じてください。 80 ° C（後の時点での一酸化窒素測定用） – でラベルされたバイアルと凍結で灌流液のサンプルを保管してください。 サンプルポートを要約し、開始する前に、すべてのストップコックが開いていることを確認してください流れ。 9。代表的な結果私たちのクイックシード法を用いて、ヒト血液由来の内皮前駆細胞は、15分間チタンのスライド上に播種し、15ダイン/ cm 2の生理（動脈）せん断力の下に付着することができます。 図10に示すように、EPCは657に、すぐに播種後、210からの流れの影響± 11.4μm2の下に広がって3時間後、及び1152 ± 39.1μm2と ± 15の流体せん断応力の24時間後に55.3μm2とダイン/ cm 2（群間差は p <0.0001、1元配置分散分析で統計的に有意である）。光や蛍光灯のどちらか顕微鏡で透明な容器を通して撮影可能セル面積の増加、に平行、真円度は式（2）6にしたがって計算/ files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg"/> 878 × 10 -3 ± 5.9 671 × 10 -3、すぐに播種後、× 10 -3 ± 19.2 × 10 3時間後に-3、に526 × 10 -3 ± 19.2 × 10 -3 48時間後から減少同じ流体のせん断応力の曝露から（群間差は p <0.0001、1方向ANOVAと再び統計的に有意である）。 図11Dは、図11Aに示すように6時間の静的な播種期、後にランダムな方向に比べて、そのEPCは、15ダイン/ cm 2の流体せん断応力の48時間後の流れの方向に整列して向きを示しています。 我々の手法は、分析および/または分泌細胞の代謝物の定量化のための所定の時点で灌流液のサンプルを入手することができます。代表的な例として、私たちは生産を表しています図12のブタEPCSに48時間の流れの実験中-亜硝酸る（NO 2）。我々は、直接6時間で12.0 nmolの、12時間で13.1 nmolの、24で16.3 nmolのように異なる時点で流れ回路から採取した培地試料中のNOのためのサロゲートマーカーとしての一酸化窒素（NO）のこの主要な酸化生成物を測定時間、および15ダイン/ cm 2 6で1 × 10 6個の細胞のための48時間後に24.6 nmolの。 図1のフロー回路の組み立てや流れの実験の概要を示す回路図。フローチャンバーなし（A）フロー回路アセンブリ。貯水池、パルスダンパー、ハードチューブ、ソフトチューブ、4ウェイのコックと接続されているルアーアダプターだけでなく、エアフィルターはここに含まれる。 （B）流量のポンプヘッドにハードチューブのセグメントを経由してフローチャンバーを接続する。 （C）でフローチャンバー（D）の底板にEPC -シードのスライドのsertion。フローチャンバーを使用して、フロー回路の組み立てを完了する。 図2：完全滅菌のためのフロー回路を組み立てた。 図3：付属のコックで滅菌した後、流れの回路を組み立て。 図4。EPC培地125 mlのガラス製リザーバーの充填。 図5。フローの回路は、前のフローチャンバーの挿入に流量ポンプヘッドにクランプ。 JPG"/> 図6。トップチャンバープレートアセンブリ。 図7。チャンバーの流入側から気泡を除去するためにEPC培地でバブルトラップのフラッシュ。 図8。チャンバーのスライドと流出側から気泡を除去するためにEPC培地でチャンバーのフラッシュ。 図9。流動実験中に挿入されたフローチャンバーで完全に組み立てられたフロー回路。 図10。EPCの面積は（μm2との）流れの実験の時間の経過とともに増加する。 files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg"/> 図11（）× 6時間前の100 ×の倍率で流れにフィブロネクチンコーティングしたスライドガラス上に播種HUCB EPCの光学顕微鏡像。 （B）チタンスライド前の流れに15分間×にCTOと迅速なシードで標識HUCBのEPCは、100 ×の倍率での蛍光顕微鏡で可視化した。 HUCB EPCSに（C）同じチタンスライド下のような（B）、100ダイン/ cm 2でのフローの3時間後と100 ×の倍率で透明なチャンバーを撮像。フローの3時間後の細胞の広がりが、それでもランダム向きに注意してください。今100 ×の倍率でフローへの暴露の48時間後に（D）と同じチタンスライド、。 EPCのCTOおよび細胞核で標識されていますが、フローの後にHoechst色素（青）で染色されています。流れの方向のセルの配置を注意してください。 （E）チタン上の比較のためにブタのEPCは流れの48時間と15ダイン/ cmの後<supせん断応力の曝露の> 2。セルの罫線は抗PECAM染色（緑）とSYTOXオレンジ核酸染色で核を染色した。流れの方向にセルの配置を注意してください。 図12グラフは、流量の48時間の間にブタのEPCのNO産生を示していない。 NOの主要な酸化生成物、亜硝酸（NO 2 – ）、フロー中に異なる時点で採取した培地試料からのNOのためのサロゲートマーカーとして測定した。 図13。フローチャンバーは、上部セクションの次元で（）0.5という"× 2"× 7"と底部（B）0.25"× 2"× 7"で、アルミ合金6061長方形の在庫から作られています。トップは、"上部が0.125、その中央部に凹んでいる。シーリングのための平坦性を保証するために"0.45にその下面O -リングの接触面に予定だった、X 1.375"フルードリザーバー"0.3125のため終了につき、"0.95を残している。上部セクションの貯水池は、"スレッド化ステンレス鋼のプラグを受け取るように深い3/8-24 TPIと0.25スレッド化されています。 "× 0.625"1 / 16を測定するスロットは、貯水池に浸透底面に機械加工された。流入側のプラグは、三方活栓に接続するホース口"ポリプロピレン1 / 8穴を通して"32分の10を持っています。各ユニットの終わりには、0.25"ポリプロピレン1 / 8の深い部分"0.45"× 2"最後にホースを中心部に位置するスレッド32分の10 TPIを持っています。 "貯水池に浸透することによってスレッドの底から穴。上部セクションの下側はテーパーエリア0.6875持っている"端は0.07を使用して1.460の距離"のためのLHのスロットの中心から0.518度、広いし。このテーパGLASの終わりから"0.6875"幅× 0.0118"深いと0.590フラットエリアにブレンドの（または他の表面、例えばチタンスライド）休会。スライドがインストールされていると、このフラットは、ガラス（または他の表面、例えばチタンスライド）と同じ高さでなければなりません。テーパーとフラットが研磨されています。スライドの表面は0.0118"下側の表面から奥に入った。0.0118"される凹部はRH端に貯留スロットに続く。 O -リングは、O -リング溝とスライドの間に、元の面の0.020残しスロットおよびスライド"の周りに完全に奥に入った状態になります。上部と下部のユニットは、10個の穴を開けている。上部のセクションは、32分の8 TPI皿フラットのためのクリアランス穴を持っている頭のネジ。下部のセクションには、上部の穴に一致する配置した穴があり、32分の8 TPIをスレッド化されています。下部のユニットが細胞表面のガラスのスライド（またはチタンスライド）上にある、その表面に透明なガラスのスライド窓埋め込み式のフラッシュを持っている。単位は底のスライドと内側のO -リング溝との間の元の表面の0.04"を残すために幅とトップユニットのスロットを包含するO -リングの溝があり。 O – RINGSは、底部の赤いシリコン上のセクションのためのAS568A、ダッシュ番号044と046です。