Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o seguinte protocolo. Nota de segurança: Todo o material que tem estado em contacto com partículas virais montado precisa ser desinfetado com solução de Virkon ou desinfetante adequado. 1. Preparação de estoques de DNA plasmidial (~ 2 dias) Os plasmídeos são necessários os seguintes 1: pRV1 – Contendo a Rep AAV2 e seqüências de Cap PH21 – Contendo a Rep AAV1 e seqüências de Cap pFdelta6 – Adenovirus helper-plasmídeo AAV plasmídeo contendo o cassete de expressão recombinante ladeado por AAV2 sinais de embalagem (repete terminal invertido, ITRs) Enquanto pFdelta6 devem ser cultivadas em células Stbl2 competente para evitar a supressão parcial, e pRV1 PH21 podem ser cultivadas em células DH5alpha competente. Plasmídeos AAV podem ser cultivadas em células Stbl2 se deleções parciais ocorrem nas células DH5alpha. Plasmídeo de DNA deve ser de alta qualidade e livre de contaminantes RNA. Plasmídeos podem ser rastreados para a integridade usando o seguinte digere: pRV1 – digerir com XbaI para dar as bandas de 7,5 kb e 3,8 kb PH21 – digerir com EcoRI para dar as bandas de 4,5 kb, 2,8 kb e 0,2 kb pFdelta6 – digerir com HindIII para dar as bandas de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb e 1,5 kb 2. Preparação de células embrionárias humanas Kidney 293 (Hek293) para transfecção (2-3 dias) Placa de duas 80% confluentes 150 centímetros dois frascos de células em cinco Hek293 15 centímetros de diâmetro Nunc placas de cultura de tecido. As células devem ser 70-80% confluentes antes de transfecção (aproximadamente 48 horas após o plaqueamento). Cultura em células modificadas padrão Dulbecco Águia (DMEM) com glicose baixa contendo 10% de soro fetal bovino e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina 100 mg / ml. 3 horas antes de transfecção DMEM remover e substituir com Iscove'Medium s modificado Dulbecco (IMDM) contendo 5% de soro fetal bovino. 3. Transfecção de plasmídeos viral (~ 1 hora para transfecção, 3 dias para incubação) Prepare o seguinte para um único lote (5 x 15 cm placas de cultura de tecido) do vírus: 62,5 mg AAV plasmídeo 125 mcg pFdelta6 31,25 mg pRV1 31,25 mg PH21 1650 mL 2,5 M CaCl 2 12 ml dH 2 O Em um filtro de tecido classe 2 capô cultura estéril a mistura de transfecção em um tubo de 50 ml. Enquanto vórtex a solução, adicionar rapidamente 13 ml de 2 x HEPES solução salina tamponada (pH 7,05). Substituir a tampa do tubo de 50 ml e continuar a vortex por 15 segundos. Deixar repousar por 1 minuto 45 segundos, um precipitado branco fino deve formulário. Delicadamente adicionar 5 ml da solução de transfecção para cada 15 centímetros placa de cultura de tecidos. Placas agite para misturar e voltar a incubadora. 16 horas após a transfecção remova o meio de IMDM e substituir com DMEM. 4. Lise de células e colheita de rAAVs (2 horas) 72 horas após a transfecção, remova a mídia de placas de cultura de células e descarte. Todos os resíduos devem ser tratados com solução de Virkon ou desinfetante adequado. Lavar cuidadosamente as células de fosfato de 1x quente solução salina tamponada (PBS, pH 7,4). Adicionar 25 ml PBS quente para cada prato e retire cuidadosamente as células com um raspador de celular. Coletar suspensão em tubos de 50 ml. Células pelota a 800 xg por 10 minutos. Elimine o sobrenadante e ressuspender pellet em 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, use 10 ml por placa de cultura de tecidos. Dividido em dois tubos de 50 ml. Prepare uma nova solução de desoxicolato de sódio a 10% em dH 2 O. Adicionar 1,25 ml desta a cada tubo para uma concentração final de 0,5%. Adicionar benzonase nuclease a uma concentração final de 50 unidades por ml. Mix tubo completamente. <li> Incubar a 37 ° C por 1 hora. Remover os restos celulares por centrifugação a 3000 xg durante 15 minutos. Transferir para tubo de 50 ml fresco, garantir que todos os restos celulares foi removido para evitar o bloqueio de colunas heparina (ver passo 5). Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C antes de continuar. Temos armazenado amostras por várias semanas a -20 ° C sem uma redução na infectividade. 5. Purificação coluna de heparina rAAVs (2-3 horas) Setup colunas HiTrap heparina usando uma bomba peristáltica para que as soluções de fluxo através da coluna a 1 ml por minuto para as etapas de 5,2-5,4. É importante garantir que não haja bolhas de ar são introduzidas na coluna de heparina. Equilibrar a coluna com 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. Aplicar solução de 50 ml de vírus para a coluna e deixar fluir. Lavar coluna com 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. Usando uma seringa de 5 ml continuar a lavar a coluna wom 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, seguido de 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. Descartar o escoamento. Usando 5 ml seringas e eluir pressão suave o vírus da coluna através da aplicação: 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 Coletar esses em um tubo de centrifugação de 15 ml. 6. Concentração e de filtração estéril de rAAVs (1 hora) Concentre-se vetor usando Amicon ultra-centrífugas quatro unidades de filtro com um corte de peso molecular 100.000. Carga 4 ml de eluído no concentrador e centrifugar a 2000 xg por 2 minutos (em temperatura ambiente). Descartar fluxo contínuo e concentrador de recarga com solução vírus restantes e centrifugação repetir. O volume concentrado deve ser de aproximadamente 250 mL. Se o volume concentrado é significativamente mais do que isso, descarte o fluxo de through e continuar a centrífuga em um minuto, até que medidas de volume é de aproximadamente 250 mL. Adicionar 250 mL de PBS ao vírus para um volume final de 500 mL e retire do concentrador. Vector através de um filtro de 13 mm de diâmetro de filtro de seringa 0,2 mm. Vector deve ser aliquotado e estocado a -80 ° C até serem necessárias. 7. A titulação de ações viral (3 dias) Isso requer um promotor que é ativo em células Hek293 dirigindo um gene repórter ou um produto de gene immunocytochemically detectável. Ao produzir um vetor que não é compatível com células Hek293 outras linhagens celulares ou culturas celulares primárias podem ser usados. Prepare 18 poli-L-lisina lamínulas de vidro revestida ou 18 poços de slides câmara Nunc semeando Hek293 células para que eles sejam 40-50% confluentes. Para a titulação de Cre-dependente rAAVs uso Hek293 células que expressam estavelmente Cre recombinase 2. Infectar cada poço com série dilutions do vetor AAV (Fig 2A). Use 3 poços por diluição. Rotineiramente adicionar vírus diretamente a cada poço. Após 72 horas fixar Hek293 células adicionando um volume igual de paraformaldeído a 4% (PFA) e médio (dando uma concentração final de PFA 2%) para 10 minutos em temperatura ambiente. Lavar celular três vezes em PBS, lavar em dH 2 O e lamela. Contar o número de células transduzidas dos três poços que têm o maior fator de diluição, mas ainda contêm células infectadas, encontrar a média destes e multiplicar pelo fator de diluição para dar o número de unidades infecciosas por microlitro (Fig 2B). 8. Resultados antecipado Hek293 células transduzidas com uma codificação do vírus proteína verde fluorescente melhorada (eGFP) são mostrados na Figura 2B. Em geral, alcançar títulos consistentes em torno de 6 x 10 6 partículas infecciosas por micro litro. Nós usam rotineiramente esses vetores para estereotáxica injection no cérebro de roedores adultos. Isto proporciona uma técnica poderosa para a região específica de expressão gênica 2. Para combinar esta especificidade região com células-tipo de expressão gênica seletiva injetamos Cre recombinase-dependente rAAVs em regiões alvo de Cre-camundongos transgênicos 2. Figura 2C-E mostra exemplos de injeções estereotáxica de Cre-dependente rAAVs codificação eGFP em diferentes regiões do cérebro de adultos parvalbumina-Cre camundongos transgênicos 3. Figura 1. Ilustração esquemática do protocolo para a produção rAAV. 1.) Hek293 células são banhados e cresceu para 70-80% confluência. 2.) Plasmídeos AAV e ajudante são preparados e transfectadas em células Hek293. 3.) Medium é alterado novamente para DMEM 16 horas após transfecção e Hek293 células são cultivadas por mais 56 horas. 4.) Hek293 células são colhidas e lisadas. rAAV vetores são separados de restos celulares por centrifugation. 5.) Partículas virais são purificados através de colunas de heparina antes da concentração e esterilização. 6.) Hek293 células são cultivadas em 24 placas bem e infectar com diluições seriadas do vetor AAV para determinar o número de unidades infecciosas. Figura 2. Titulação e em aplicação in vivo de rAAV1 / 2. (A) Instalação de Hek293 células para medir a título de viral. Hek293 células são transduzidas com diluições em série de rAAVs. C, o controle não infectados; N, 1 ml de ações virais não diluído. (B) Hek293 células infectadas com rAAVs expressar eGFP. (CE) expressão eGFP Viral é restrito a Cre-expressando neurônios nas regiões-alvo diferentes de camundongos transgênicos parvalbumina-Cre após a injeção estereotáxica de Cre-activated rAAVs. Imagens mostram exemplos imunorreatividade GFP em (C) pallidus do tálamo reticular e globus, (D) o giro denteado e (E) a região CA1 do hipocampo. DG, dentate giro; RT, reticular talâmico núcleo; GP, globo pálido. Barras de escala: B, 500 mm; C, 100 mm; D, 100 mm; E, 500 mm.