Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы
Summary
Мы описываем мультиплекс метод обнаружения микроорганизмов в образце с использованием олигонуклеотидных связью флуоресцентные бусы. Ампликона из всех организмов, в пределах образца гибридизации с панели зонда связью бисером. Luminex или Bio-Plex инструмент используется для запроса каждая бусинка для бортовых и гибридизации типа сигнала.
Abstract
Бактериальный вагиноз (БВ) является периодическим полимикробная синдром, который характеризуется изменением в "нормальной" микрофлоры из Lactobacillus доминируют в микробиоты доминируют числа видов бактерий, в том числе Gardnerella влагалищной, Atopobium влагалища и другие 1-3. Это условие связано с целым рядом негативных последствий для здоровья, включая ВИЧ приобретение 4, и это может быть трудно управлять клинически 5. Кроме того, диагноз БВ опирается на использование Грам пятна тампоном влагалищных мазков, которые забили на различные численные критерии 6,7. Хотя эта диагностическая простой, недорогой и хорошо подходит для ограниченных ресурсов, он может страдать от проблем, связанных с субъективной интерпретации и это не дает подробный профиль состав вагинальной микрофлоры 8. Последние глубокие усилия секвенирования показали, богатой, разнообразной микрофлоры вагинального счеткие различия между образцов, взятых у людей, которые с диагнозом БВ по сравнению с теми лицами, которые считаются нормальными 9,10, что привело к выявлению ряда потенциальных мишеней для молекулярной диагностики BV 11,12. Эти исследования предоставили массу полезной информации, но в глубине секвенирования еще не практичен, как метод диагностики в клинической практике. Мы недавно описанный метод для быстрого профилирования вагинальной микрофлоры в мультиплексе формате с использованием олигонуклеотидных связью люминесцентные бусины с обнаружением на платформе Luminex 13. Этот метод, как и текущие Граму основе методов, является быстрым и простым, но добавляет дополнительные преимущества использования молекулярного знания, вытекающие из исследования в последовательности зонда дизайна. Этот метод, следовательно, обеспечивает путь к профилю основных микроорганизмов, которые присутствуют в вагинальных мазка, который может быть использован для диагностики БВ с высокой специфичностью и чувствительностью макетared к Граму, обеспечивая при этом дополнительную информацию о наличии видов и изобилие в полуколичественного и быстрым способом. Этот мультиплекс метод может быть расширен за пределы диапазона текущей количественной ПЦР для отдельных организмов, которые в настоящее время ограничивается 5 или 6 различных анализов в одном образце 14. Важно отметить, что метод не ограничивается обнаружение бактерий в мазках вагинального и может быть легко адаптирована к быстро профиля практически любого микробного сообщества, представляющих интерес. Например, недавно мы начали применять эту методологию для разработки диагностических инструментов для использования в очистных сооружениях.
Protocol
Discussion
Специфику генерации сигнала имеет решающее значение, вы должны быть уверены, что сигнал, наблюдаемый действительно отражает обнаружения ампликона генерируется из этого организма. Программное обеспечение таких как PrimerPlex (Премьер Biosoft) может помочь разработать зондов, которые будут ск?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Альберто Северини и Ванесса Goleski за помощь в развитии анализа и критических комментариев к этой рукописи. Эта работа была профинансирована Агентством общественного здравоохранения Канады и Промышленная программа содействия исследованиям (National Research Council Канады). Дополнительная поддержка была получена из Университета Фонда Публикации Саскачеван.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
References
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
