Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino
Summary
Um método confiável para o isolamento do RNA<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Recuperou de cecums murino é descrito. O RNA recuperado é de quantidade e qualidade suficientes para qPCR subseqüentes, perfis de transcrição, RNA e experimentos Seq. Esta técnica pode ser adaptada para o isolamento de RNA outros micróbios intestinais.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (PA) resultado infecções em significativa morbidade e mortalidade em hosts com sistemas imunológicos comprometidos, tais como doentes com leucemia, queimaduras graves, ou transplantes de órgãos 1. Em pacientes de alto risco para o desenvolvimento de infecções da corrente sanguínea PA, do trato gastrointestinal (TGI) é o principal reservatório para a colonização 2, mas os mecanismos pelos quais as transições de um micróbio PA colonização assintomática a uma invasivo, e muitas vezes mortal, patógeno não são claras. Anteriormente, foi realizada em experimentos in vivo perfis de transcrição, recuperando mRNA PA a partir de células bacterianas residentes no cecums de ratos colonizados 3, a fim de identificar mudanças na expressão gênica de bactérias durante a alterações do estado imunológico do hospedeiro.
Como acontece com qualquer experiência de perfis de transcrição, o passo limitante da velocidade está no isolamento de quantidades suficientes de mRNA de alta qualidade. Dada a abundância de enzimas, detritos, resíduos de alimentos, e as partículas no trato gastrintestinal, o desafio do isolamento do RNA é assustador. Aqui, apresentamos um método para o isolamento fiável e reprodutível de RNA bacterianos recuperados do trato gastrointestinal de camundongos. Este método utiliza um modelo bem estabelecido murino de PA colonização GI e neutropenia induzida por difusão 4. Colonização, uma vez GI com PA for confirmada, os ratos são sacrificados e conteúdo cecal são recuperados e flash congelado. RNA é então extraído usando uma combinação de perturbação mecânica, ferver, fenol / clorofórmio extrações, tratamento de DNase, e cromatografia de afinidade. Quantidade e pureza são confirmadas por espectrofotometria (Nanodrop Technologies) e Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Este método de GI isolamento microbiano RNA pode ser facilmente adaptado para outras bactérias e fungos.
Protocol
Discussion
O método de extração de RNA descrita aqui permite a recuperação de quantidades suficientes de alta qualidade Pseudomonas aeruginosa RNA total colhido a partir do trato GI murino. Este método não é restrito a P. aeruginosa e pode potencialmente ser aplicada a outras bactérias. A recuperação de microrganismos suficientes a partir do intestino irá variar significativamente de organismo para organismo. Em nosso modelo murino, P. aeruginosa tipicamente coloniza o trato GI murino em níveis entre 5 x 10 7 a 5 x 10 8 ufc / g fezes 4. Uma vez que o conteúdo recuperado cecal são aproximadamente 0,5 grama, o número estimado de P. aeruginosa recuperou de duas cecums está entre 5 x 7-5 x 10 10 8 ufc. Se outros microorganismos são utilizados, seria prudente para verificar os níveis de colonização GI e depois calcular o número de cecums necessário para recuperar o número alvo de ufc. Também é importante notar que, ao usar este modelo em particular murino, tratado com antibióticos camundongos não infectados com o PA tem nenhum valor quantificável de RNA isolado de seu conteúdo cecal.
Nosso modelo murino de Pseudomonas aeruginosa gastrointestinal e as tentativas de divulgação para emular a patogênese de P. aeruginosa bacteremia em pacientes de câncer e transplante de células-tronco. Nesta população de pacientes, comensais da flora é muitas vezes esgotadas secundárias ao tratamento com antibióticos ou quimioterápicos (por exemplo, o esgotamento antibiótico de GI comensais flora), resultando em crescimento de micróbios patogênicos (por exemplo, mono-associação com P. aeruginosa) e posterior divulgação após a supressão imunológica. As vantagens e limitações deste modelo murino, já foram abordados anteriormente 4. O objetivo deste estudo é fornecer uma metodologia para isolar RNA total microbiana do trato GI. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros modelos murinos que estudam outros aspectos da patogênese microbiana no trato GI (ou seja, interações comensais flora, efeitos bacteriana na doença inflamatória intestinal, etc.)
Uma vantagem deste método é a incorporação das etapas de lise múltiplos, incluindo congelamento / descongelamento, a perturbação mecânica (pulverização com argamassa / pilão homogeneização), fervendo, e lise química (por exemplo SDS). Apesar da multiplicidade de etapas de lise, alguns microorganismos (principalmente bactérias gram-positivas e fungos / leveduras) podem exigir a interrupção mecânica adicional. Após a lise quente / ácido fenol-clorofórmio de incubação (Passo 3.5), a adição de contas (0,1 mm para as bactérias e / ou 0,5-0,7 mm para levedura) e um passo-a bater talão subseqüentes deve ser suficiente para lisar estes 9 organismos, 10.
Dada a natureza complexa de materiais recuperados a partir do ceco murino, o frio acid-phenol/chloroform repetidas extrações (Passo 3,7-3,9) são absolutamente necessários para atingir a qualidade aceitável RNA e integridade para outras reações a jusante. Entre 3-5 frio acid-phenol/chloroform extrações podem ser necessários antes que a interface branco entre as fases aquosa e orgânica é eliminada. Finalmente, a combinação de ambos o tratamento DNase (Etapa 4) e Protocolo de Limpeza RNeasy (Passo 5) são essenciais para a remoção de DNA contaminante e pequenas não mRNA (5s e tRNA). Como dito anteriormente, o RNA recuperado através da utilização deste protocolo é de quantidade e qualidade suficientes para posterior transcrição perfil 3, qPCR (não publicado), e Seq RNA (não publicado) experimentos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Mortar and Pestle | Fisher | 12-947-1 |
| Homogenizer | Omni | TM-125 |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050 |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 |
| DNase | Ambion | AM2238 |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
References
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