Une méthode de génotypage basé sur la PCR pour distinguer les variétés de type sauvage et les plantes ornementales de Imperata cylindrica</em

1. Prélèvement et conservation Cette méthode a été développée et testée en utilisant frais, congelés, et les tissus foliaires récemment séché. Identifier imperata cylindrique et / ou JBG tissus à l'aide d'un taxonomiste qui se spécialise dans l'herbe l'identification des espèces. Avec ses feuilles rouges lumineuses, JBG ornementale est facile de distinguer visuellement de type sauvage et imperata cylindrique JBG revenir, mais imperata cylindrique et JBG revenir sont presque impossibles à distinguer les uns des autres. Imperata cylindrique et le phénotype JBG revenue avoir verts, les feuilles plus longues, les rhizomes nettement plus étendues et plus, et la région plus de feuilles que JBG 12 (Figure 1). Tissus de la feuille fraîche fournit l'ADN de la qualité la plus abondante et la plus élevée et peut être recueillie à partir du champ ou en serre I. plantes cylindrica. Si les tissus frais doit être utilisé, extraire de l'ADN dans les 3 heures suivant le prélèvement pour aider à prévenir la dégradation. Sinon, préparez les tissus pour le stockage, keeping le tissu frais et à la lumière du soleil directe. Pour stocker les tissus pour l'extraction d'ADN à une date ultérieure, la méthode la plus optimale consiste à congeler et conserver le tissu à -80 ° C immédiatement. Ne laissez pas le tissu congelé pour dégeler avant extraction de l'ADN. Transférer le tissu congelé dans l'azote liquide avant les étapes de broyage de l'extraction d'ADN pour empêcher la décongélation. Si un congélateur à -80 ° C n'est pas disponible, le tissu sèche immédiatement. Pour le stockage à sec, placez le tissu dans une enveloppe en papier et de stocker l'enveloppe dans du gel de silice déshydraté ou d'autres déshydratants actifs à la température ambiante. Une petite quantité de silice indicateur mélangé avec de la silice non-indiquant veillera à ce que la silice est entièrement déshydraté et approprié pour le séchage des tissus végétaux. Utilisez au moins 10 fois gel de plus de silice que les tissus de feuilles fraîches en poids. Les tissus végétaux doivent sécher dans les 24 heures. La qualité et la quantité d'ADN est réduite par le stockage à sec au cours du temps (comme dans le cas de spécimen d'herbiers). 2. Extraction de l'ADN Pour extraire l'ADN d'un tissu végétal, suivre le DNeasy usine Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69104 ou 69106) les instructions du fabricant avec une modification mineure. Au lieu d'utiliser l'a suggéré à moins de 100 mg de tissu frais ou inférieure à 20 mg de tissu sec pour chaque colonne, meuler supérieure à 100 mg, puis de transférer 100 mg de tissu frais ou congelé (ou> 20 mg de tissu sec) dans des tubes appropriés pour l'extraction. L'ADN nucléaire et plaste est extrait simultanément. Avant de commencer ces procédures, vérifiez que l'éthanol a été ajouté à tampons AP3 / E et AW. Broyer> 100 mg de tissu de feuilles fraîches ou congelées (ou> 20 mg de tissus de la feuille sèche) en une fine poudre à l'aide de trois séries de l'azote liquide avec un broyage dans un mortier et un pilon réfrigérés. Perturbations insuffisante du matériau de départ ou de lyse insuffisante peut également conduire à une baisse des rendements de l'ADN. Soigneusement moudre le tissue et ne surchargez pas les colonnes avec trop de tissu. Transférer 100 mg, poudre à partir de tissus congelés frais ou congelé (ou 20 mg de poudre à partir de tissu sec) à un microtube de 1,5 ml contenant 400 ul de tampon AP1 et 4 pl de RNase A. Chaque tube peut être placé dans un rack sur une petite équilibrer pour surveiller le poids exact du tissu par tube. Échantillon Vortex ou un bougé de (s) pour mélanger et incuber pendant 10 min à 65 ° C, en inversant le tube (s) 2-3 fois pendant l'incubation. Ajouter 130 pi de tampon AP2 à chaque échantillon. Mélanger en inversant le tube (s) à plusieurs reprises, et incuber pendant 5 min sur la glace. Pipeter chaque lysat dans une colonne spin QIAshredder Mini séparée, et placer chaque colonne dans un tube de 2 ml de collecte (fourni avec le kit). Centrifugeuse colonne (s) pendant 2 min à 20.000 xg (~ 14000 rpm), et transférer chaque accréditives fraction dans un nouveau tube (non fourni avec le kit) sans perturber formé à granulés. Ajouter 1,5 volumes de tampon AP3 /E, et mélanger à la pipette. Transfert 650 ul du mélange dans une colonne spin Mini DNeasy dans un tube de 2 ml de collecte. Centrifugeuse colonne (s) pendant 1 min à 6000 xg (~ 8000 rpm), et jeter le accréditives. Répétez cette étape avec le reste du mélange pour chaque échantillon. Placer la colonne spin (s) dans un nouveau tube collecteur de 2 ml (s), et ajouter 500 ul de tampon AW vers le haut de chaque colonne. Centrifugeuse colonne (s) pendant 1 min à 6000 xg (~ 8000 rpm), et jetez-débit par le biais. Ajouter une autre de 500 ul de tampon AW vers le haut de chaque colonne. Centrifuger pendant 2 min à 20.000 xg (~ 14000 rpm). Cette étape va sécher la colonne, éliminant ainsi toute l'éthanol résiduelle contenue dans les tampons qui peuvent inhiber la PCR. Transférer chaque colonne spin à un nouveau tube de 1,5 ml d'échantillon microcentrifugeuse. Ajouter 100 pi de tampon AE vers le haut de chaque colonne pour l'élution, et incuber la colonne (s) pendant 5 min à température ambiante. Centrifugeuse colonne (s) pendant 1 min à 6000 xg (~ 8,000 rpm) pour recueillir l'ADN. Répétez ces étapes d'élution un moment donné, éluer l'ADN dans le même tube de 1,5 ml de microcentrifugation pour donner 200 pi d'échantillon. Des échantillons d'ADN doivent être stockées à -20 ° C jusqu'à son utilisation. Concentrations d'ADN dépendent du type de tissu et les conditions de stockage. Rendements optimaux sont obtenus lorsque l'ADN élution avec un total de 200 pi de tampon AE; cependant, les concentrations peuvent être augmentées si les volumes d'élution sont réduits à aussi peu que 50 pl. 3. Vérification de la qualité de l'ADN et la quantité Testez la qualité et la quantité d'ADN extrait avant l'installation PCR en utilisant un spectrophotomètre ou fluorimètre et électrophorèse sur gel. Cela aidera à assurer le succès des étapes ultérieures. L'utilisation d'un spectrophotomètre, la qualité et la quantité d'ADN d'essai. Rendements d'ADN bonnes devrait se situer entre 50 et 150 ng / ul avec 260/280 et 230/280 ratios proches de 2.0. A titre d'exemple, la figure 2 montre les résultats de bonne qualité en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE). Effectuer l'électrophorèse sur gel en utilisant un standard d'agarose 1%. Vérifiez la présence de bandes relativement importantes (> 10 Ko) sans stries à peu de la contamination d'ARN (Figure 3). Si la concentration en ADN est élevé, des échantillons d'ADN dilués à 70 ng / ul pour les étapes ultérieures. 4. Les amorces de PCR Les amorces de PCR utilisées dans ce protocole sont basées sur des différences de séquences entre la région espaceur trnL-F plaste de génotypes imperata cylindrique et JBG. Ces différences se présentent sous forme de SNP (Single Nucleotide Polymorphism) et les indels (insertions et suppressions) qui ont permis le développement de la variété des amorces spécifiques en localisant les amorces sur les sites de séquences uniques (Figure 4). La qualité des amorces peuvent avoir un impact significatif sur les résultats de la PCR. Amorces de commande à partir d'une entreprise digne de confiance. Nous commandons nos amorces de Oblique Bio, Inc (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), demandant que les procédures standard de dessalement. trnL-F amorces de contrôle positifs: Ce jeu d'amorces amplifie la région espaceur plaste trnL-F de la plupart des taxons herbe 11-13 et sert un bon contrôle positif (résultant dans une bande de 890 pb). Nom Séquence trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (exon 5 ')-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' De type sauvage amorces imperata cylindrique: Ce jeu d'amorces est spécifique à imperata cylindrique et ne pas amplifier la région trnL-F de JBG génotypes. Les résultats présentés dans un groupe qui est de 595 pb. Nom Sequence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' JBG JBG et Revert amorces: Ce jeu d'amorces est spécifique à JBG génotype et n'amplifie pas la région trnL-F de imperata cylindrique. Les résultats présentés dans un groupe qui est de 594 pb. Nom Séquence trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' Remettre en suspension chaque amorce dans un volume suffisant de nucléase-free O ddH 2 pour obtenir un 100 mm Stock solutions qui peuvent être stockés à -20 ° C, à long terme. Diluer chaque stock d'amorce à 12 mm avant les étapes de configuration de PCR. 5. PCR Setup Extraction d'ADN sont amplifiés en utilisant chacun des ensembles d'amorces susmentionnées dans des réactions de PCR. Inclure un contrôle positif afin de s'assurer que tous les réactifs de PCR sont bien fonctionner et peut générer une bande. Inclure un contrôle négatif pour s'assurer qu'aucun des réactifs sont contaminés avec de l'ADN non désirées. Le contrôle négatif ne contient pas de modèle-et devrait aboutir à aucune production de bande. Préparez toutes les réactions dans des tubes PCR à paroi mince pour permettre un meilleur transfert de chaleur entre le bloc thermocycleur et l'échantillon. Nous vous recommandons d'utiliser des aérosols disponibles dans le commerce sans embouts de pipette pour éviter la contamination. Pour chaque échantillon d'ADN isolé, mis en place 50 ul réactions de PCR utilisant chacun des ensembles d'amorces ci-dessus dans 0,2 ml tubes PCR à paroi mince en ajoutant les réactifs suivants sur la glace dans l'ordre indiqué ci-dessous. Si plusieurs échantillons sont en cours de préparation, faire un cocktail contenant tous les réactifs à l'exceptionde la matrice d'ADN pour établir des conditions uniformes entre toutes les réactions. Réactif PCR Volume d'occasion Concetration final Nucléase-free ddH 2 O 40,5 pi 10X Advantage 2 PCR Buffer (Clonetech, CA) 5,0 pl 10% (v / v) Avantage UltraPure PCR dNTP Mix (10 mM chacun, Clonetech, CA) 1,0 pl 0,2 mM Primer 1 (12μM dans le trou DDH 2 O) 1,0 pl 0,24 uM Primer 2 (12μM dans le trou DDH 2 O) 1,0 pl 0,24 uM Mix Polymerase Avantage 2 (Clonetech, CA) 0,5 pl 1% (v / v) Extraction de l'ADN(70 ng / réaction; ajuster ddH volume 2 O en fonction des besoins) 1,0 pl 1,4 ng / ul Total: 50,0 pi Afin de s'assurer que tous les réactifs de PCR sont bien fonctionner, configurer le contrôle positif à l'aide des amorces de contrôle positifs. Ce jeu d'amorces fonctionne aussi bien pour imperata cylindrique, JBG, JBG revenir et d'autres graminées et se traduira par un groupe qui est de 890 pb. Configurer le contrôle négatif en utilisant l'amorce même contrôle défini comme le contrôle positif, à l'aide ddH 2 O au lieu de l'extraction de l'ADN. Si tous les réactifs sont exempts de l'ADN contamine, cette réaction se traduira par aucune bande. Si la concentration en ADN est faible, plus l'ADN peuvent être ajoutés à chaque réaction, en ajustant la quantité de nucléase-free O ddH 2 d'occasion pour porter le volume total de réaction de 50 ul. Ne pas utiliser plus de 5 pi de l'ADN (10% des le volume total) par reaction, les impuretés que possible contenues dans les échantillons d'ADN peuvent inhiber les réactions PCR. 6. PCR à vélo Effectuer amplifications par PCR dans un thermocycleur équipé d'un couvercle chauffant à l'aide des paramètres suivants à vélo PCR. Nous utilisons le Mastercycle pro S thermocycleur (Eppendorf, Hauppauge, NY) réglé pour fonctionner avec des conditions standard de température de rampes. Toute thermocycleur qualité devraient bien performer. Cycle Dénaturation Recuit Polymérisation 1 2 min à 95 ° C 2 30 sec à 95 ° C 30 sec à 61 ° C 90 sec à 68 ° C 35 cycles 3 5 min à 68 ° C Maintenir à 4 ° C jusqu'à ce que l'échantillon est retirée </td> Optimiser les conditions de PCR (y compris la température de recuit primaire, le temps de vulgarisation, et le nombre de cycles) selon les besoins en fonction de la qualité de l'ADN, les amorces, la Taq polymérase ou le type de thermocycleur utilisé. Nous vous recommandons d'utiliser un thermocycleur gradient capables lorsqu'il s'agit de déterminer l'optimal températures de recuit. Si le thermocycleur utilisé n'a pas de couvercle chauffant, ajouter une goutte d'huile minérale à la partie supérieure de chaque échantillon pour empêcher l'évaporation durant le cyclage de PCR. 7. Électrophorèse sur gel des produits de PCR Pour visualiser les résultats de l'analyse, séparés des produits de PCR sur un gel d'agarose 1% en utilisant l'électrophorèse standard. Mélanger 2 ul d'un tampon de chargement standard de l'ADN (généralement une solution 5x ou 6x) avec 5 pi de chaque produit amplifié par PCR. Charger les échantillons sur un gel d'agarose 1% contenant EtBr (bromure d'éthidium pour coloration de l'ADN) fait avec esystèmes tampons ither TAE ou SB (borate de sodium) 16. Nous utilisons 1 pi d'une 10 mg / ml solution mère EtBr par 100 ml d'agarose 1% (0,1 pg / ml). Exécuter échantillons à ~ 120 jusqu'à ce que le front atteint ¾ de la longueur totale du gel. Sous une lumière ultraviolette (par exemple une boîte de courte longueur d'onde la lumière UV), d'inspecter les bandes résultant de voir si un fragment approprié a été amplifié. Documenter le gel et les bandes résultant en utilisant une disposition de photo-documentation du système ou l'appareil photo. 8. Les résultats représentatifs Lors de la visualisation des produits de PCR, imperata cylindrique a un motif unique de bandes par rapport à celle de JBG ou rétablie JBG (figure 5). Pour chaque échantillon d'ADN, l'ensemble F-trnL positif amorce de contrôle devrait se traduire par un seul haut-intensité de la bande à ~ 890 pb. Cela permet de vérifier que tous les réactifs de PCR sont bien fonctionner. De même, le contrôle négatif (pas de modèle) la réaction ne doit pas contenir des bandes pour toute s amorceet utilisé. Cela permet de vérifier qu'aucun des réactifs ont été contaminés. Si l'échantillon d'ADN est dérivé de type sauvage imperata cylindrique, une réaction de PCR en utilisant le jeu d'amorces imperata cylindrique spécifique se traduira par une seule bande à ~ 595 pb, tandis que les amorces spécifiques JBG se traduira par aucune bande. De même, si l'échantillon d'ADN est dérivée de JBG JBG ou rétabli, une réaction de PCR en utilisant le jeu d'amorces JBG-spécifique se traduira par une seule bande à ~ 594 pb, tandis que les amorces spécifiques imperata cylindrique se traduira par aucune bande. Parce que JBG JBG, et revint ont identiques séquence d'acide nucléique, ils ont donc des profils de bandes identiques. Si de nombreux échantillons doivent être comparés sur un gel dans le même temps, nous vous recommandons d'exécuter tous les échantillons provenant de chaque amorce situé à côté de l'autre, ce qui rend plus facile à balayer les échantillons pour obtenir des résultats positifs. Les différences morphologiques entre les JBG JBG et revient sont assez évidents (par exemple la couleur rouge des feuilles et plus petite taille de JB G vs la coloration verte, plus grande stature et la croissance agressive de la JBG revenir), et bien que les résultats de PCR sera le même, les variétés JBG sont faciles à distinguer à l'aide morphologie de la plante. Figure 1. Comparaison des culture en serre Imperata cylindrica var. Koenigii (herbe de sang japonais), robot I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) et I. cylindrica (Wild-type de imperata cylindrique). Figure 2. Un exemple d'échantillons d'ADN vérifiées à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop. Noter que, indépendamment du spectrophotomètre utilisé, le rapport 260/280 doit être proche de 1,8 et le rapport 260/230 doit proche de 2,0. ontenu "> Des échantillons d'ADN Figure 3. Vérifiée par électrophorèse sur gel standard sur un gel d'agarose 1%. Un marqueur d'ADN commercial a été utilisé pour l'analyse granulométrique. Lane # 4 est un exemple de l'échantillon d'ADN de qualité médiocre, montrant bavures et une certaine contamination ARN. Alignements de séquences Figure 4. Des régions trnL-F de Imperata cylindrica var. Koenigii (herbe de sang japonais), robot I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) et I. cylindrica (Wild-type de imperata cylindrique). Vertical flèches noires indiquent des différences dans les séquences résultant de SNPs et indels. Horizontaux flèches vertes indiquent les positions des amorces imperata cylindrique de type sauvage utilisés pour imperata cylindrique-PCR spécifique. Horizontaux flèches rouges indiquent la positions de la JBG JBG et Revert amorces utilisées pour JBG-PCR spécifique. Figure 5. Résultat représentative de l'électrophorèse sur gel des produits de PCR dérivés de imperata cylindrique, et JBG JBG revenir échantillons d'ADN associés à des imperata cylindrique et JBG amorces spécifiques ainsi que l'trnL-F témoin positif et un contrôle de modèle pas négative.