Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica</em

1. Specimen verzamelen en bewaren Deze methode is ontwikkeld en getest met behulp van vers, bevroren, en sinds kort gedroogd blad weefsels. Identificeer cogongrass en / of JBG weefsels met behulp van een taxonoom dat gespecialiseerd is in grassoorten identificatie. De helderrode bladeren sier JBG gemakkelijk visueel te onderscheiden terug van wild-type en cogongrass JBG, maar cogongrass en JBG weer bijna niet van elkaar. Cogongrass en de JBG teruggekeerd fenotype hebben groene, langere bladeren, aanzienlijk groter en langer wortelstokken, en meer bladoppervlakte dan JBG 12 (figuur 1). Fresh bladweefsel biedt de meest voorkomende en hoogste kwaliteit DNA en kunnen worden verzameld van het veld of in de kas geteeld I. kokervormig planten. Als sel wordt gebruikt, extract DNA binnen 3 uur verzameling om afbraak te voorkomen. Anders, voor te bereiden weefsel voor opslag, keeping het weefsel koel en niet in direct zonlicht. Om weefsels voor DNA-extractie op te slaan op een later tijdstip, de meest optimale methode is te bevriezen en het weefsel op te slaan bij -80 ° C onmiddellijk. Zorg ervoor dat de bevroren weefsel te ontdooien voor DNA-extractie. Breng de bevroren weefsel om vloeibare stikstof voorafgaand aan het slijpen stappen van DNA-extractie om te voorkomen dat het ontdooien. Als een -80 ° C vriezer niet beschikbaar is, droog het weefsel onmiddellijk. Voor droge opslag plaats het weefsel in een papier enveloppe en slaan de enveloppe in gedehydrateerde silica gel of andere actieve droogmiddelen bij kamertemperatuur. Een kleine hoeveelheid silica indicator gemengd met niet-aangegeven silica zorgt ervoor dat silica volledig gedehydrateerd en voor drooginstallatie weefsel. Gebruik van ten minste 10 keer silicagel dan verse bladweefsel gew. Plantenweefsel, drogen binnen 24 uur. De kwaliteit en kwantiteit van DNA wordt verminderd door droog opslag gedurende tijd (bij herbarium monsters). 2. DNA-extractie Om DNA te extraheren uit plantenweefsel, volg dan de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69104 of 69106) instructies van de fabrikant met een kleine wijziging. In plaats van de voorgestelde minder dan 100 mg sel of minder dan 20 mg droog weefsel voor elke kolom malen groter dan 100 mg en 100 mg overbrengen van verse of bevroren weefsel (of> 20 mg van droog weefsel) passende buizen voor extractie. Nuclear en plastide DNA gelijktijdig geëxtraheerd. Voordat u deze procedures, controleert u of ethanol is toegevoegd aan buffers AP3 / E en AW. Gemalen> 100 mg van verse of bevroren bladweefsel (of> 20 mg droog bladweefsel) tot een fijn poeder met drie rondes van vloeibare stikstof malen in een gekoelde vijzel. Onvoldoende verstoring van het uitgangsmateriaal of onvoldoende lysis kan ook leiden tot lagere opbrengsten van het DNA. Voorzichtig maal de Tissue en niet te veel de kolommen met te veel weefsel. Breng 100 mg bevroren poeder uit vers bevroren of weefsel (of 20 mg van poeder uit droog weefsel) met een 1,5 ml microcentrifugebuisje met 400 ul Buffer AP1 en 4 pi RNase A. Elk buis in een rek geplaatst worden op een evenwicht op het juiste gewicht van het weefsel per buis te controleren. Vortex of schud monster (s) te mengen en incuberen gedurende 10 min bij 65 ° C, het buisje (s) 2-3 maal gedurende incubatie. Voeg 130 ul buffer AP2 aan elk monster. Meng door het buisje (s) meerdere keren, en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Pipet elk lysaat in een aparte QIAshredder Mini spin-kolom, en leg elke kolom in een 2 ml verzamelbuis (voorzien van de kit). Centrifuge kolom (men) gedurende 2 min bij 20.000 xg (~ 14.000 rpm), en breng elke flow-through fractie in een nieuwe buis (niet meegeleverd met de kit) zonder verstoring van eventueel gevormde pellet. Voeg 1,5 volumes buffer AP3 /E, en mengen door pipetteren. Breng 650 pi van het mengsel in een DNeasy Mini draai kolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) en gooi de doorstroming. Herhaal stap met het resterende mengsel van elk monster. Plaats de spin kolom (s) in een nieuwe 2 ml verzamelbuis (s) en voeg 500 ul Buffer van AW naar de top van elke kolom. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) en gooi doorstroming. Voeg nog een 500 pi van buffer AW naar de top van elke kolom. Centrifugeer 2 min bij 20.000 xg (~ 14.000 rpm). Deze stap droogt de kolom, waardoor elke resterende ethanol in de buffers die remmen PCR. Overdracht elke spin kolom naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis monsterbuis. Voeg 100 ul Buffer AE naar de top van elke kolom voor elutie en incuberen kolom (s) 5 min bij kamertemperatuur. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) het DNA te verzamelen. Herhalen elutie stappen een keer, elueren de DNA in dezelfde 1,5 ml microcentrifugebuisje tot 200 ul van het monster te verkrijgen. Winkel DNA bij -20 ° C tot gebruik. DNA-concentraties afhankelijk weefseltype en opslag. Optimale opbrengsten worden verkregen wanneer geëlueerd DNA met een totaal van 200 pi buffer AE, maar concentraties kan worden verhoogd als elutievolume gereduceerd tot slechts 50 pi. 3. Verificatie van de DNA-Kwaliteit en kwantiteit Test de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerd DNA voorafgaand aan PCR setup met behulp van een spectrofotometer of fluorometer en gel elektroforese. Dit zal helpen waarborgen het succes van de volgende stappen. Met behulp van een spectrofotometer, test-DNA-kwaliteit en kwantiteit. Goede opbrengsten DNA moet tussen 50 en 150 ng / pl met 260/280 230/280 verhoudingen nabij 2,0. Als voorbeeld figuur 2 goede resultaten met de NanoDrop spectrofotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE). Voer elektroforese met een standaard 1% agarose gel. Controleer de aanwezigheid van relatief grote banden (> 10 Kb) zonder weinig strepen van RNA verontreiniging (figuur 3). Als de DNA-concentratie hoog is, verdund DNA monsters 70 ng / pl voor latere stappen. 4. PCR primers De PCR-primers die in dit protocol zijn gebaseerd op de volgorde verschillen tussen de plastide trnL-F spacer regio cogongrass en JBG genotypen. Deze verschillen komen in de vorm van SNPs (single nucleotide polymorphisms) en indels (Invoegen en verwijderen) dat de ontwikkeling van verschillende-specifieke primers door het lokaliseren van de primers op de sites van unieke sequenties (figuur 4) toegestaan. De kwaliteit van de primers kan een aanzienlijke invloed op de PCR resultaten. Bestel primers van een gerenommeerd bedrijf. We bestellen onze primers van Oblique Bio, Inc (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), met het verzoek alleen standaard ontzouting procedures. trnL-F positieve controle primers: Deze primer set versterkt de plastide trnL-F spacer regio van de meeste gras taxa 11-13 en dient als een goede positieve controle (wat resulteert in een 890 bp band). Naam Volgorde trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 'exon)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' Wild-type cogongrass primers: Deze primer set specifiek cogongrass en niet versterkt de trnL-F regio JBG genotypes. De set resulteert in een band die 595 bp. Naam Seqnvloeden trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' JBG en JBG Terugkeren primers: Deze primer set is specifiek voor JBG genotype en niet versterken de trnL-F regio cogongrass. De set resulteert in een band die 594 bp. Naam Volgorde trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' Resuspenderen elke primer in voldoende hoeveelheid nuclease zonder DDH 2 O een 100 mM voorraad oplossingen die worden opgeslagen bij -20 ° C, langdurige verkrijgen. Vul telkens primer voorraad tot 12 mm voor de PCR-setup stappen. 5. PCR-Setup DNA extracties geamplificeerd met elk van de bovenvermelde primersets in PCR-reacties. Voeg een positieve controle om alle PCR reagentia goed functioneren en een band genereren. Voeg een negatieve controle om ervoor te zorgen dat geen van de reagentia zijn verontreinigd met ongewenste DNA. De negatieve controle bevat geen-template en moet resulteren in geen band productie. Bereid alle reacties in dunwandige PCR-buisjes tot een betere warmte-overdracht tussen de thermocycler blok en het monster toe te staan. Wij raden u aan in de handel verkrijgbare spuitbussen zonder pipet tips om besmetting te voorkomen. Voor elke geïsoleerde DNA-monster, dat is opgericht 50 ul PCR-reacties gebruik van elk van de bovenstaande primer sets in 0,2 ml dunwandige PCR-buisjes door toevoeging van de volgende reagentia on Ice in de volgorde hieronder vermeld. Als er meerdere monsters worden voorbereid, maak een cocktail met alle reagentia, met uitzonderingvan de DNA-template aan uniforme voorwaarden tussen alle reacties vast te stellen. PCR Reagens Gebruikte volume Final Concetration Nuclease-free DDH 2 O 40,5 ul 10X Voordeel 2 PCR-buffer (Clonetech, CA) 5,0 pl 10% (v / v) Voordeel UltraPure PCR dNTP Mix (10 mM elk, Clonetech, CA) 1,0 pl 0,2 mM Primer 1 (12μM in DDH 2 O) 1,0 pl 0,24 uM Primer 2 (12μM in DDH 2 O) 1,0 pl 0,24 uM Voordeel 2 Polymerase Mix (Clonetech, CA) 0,5 ul 1% (v / v) DNA-extractie(70 ng / reactie; aan te passen DDH 2 O volume als nodig) 1,0 pl 1.4 ng / ul Totaal: 50,0 ul Om ervoor te zorgen dat alle PCR-reagentia goed werken, het instellen van de positieve controle met behulp van de positieve controle primers. Deze primer set werkt even goed voor cogongrass, JBG, JBG en terugkeren andere grassen en zal resulteren in een band die is 890 bp. Stel de negatieve controle met behulp van dezelfde controle primer te stellen als de positieve controle, met behulp van DDH 2 O in plaats van de DNA-extractie. Als alle reagentia zijn vrij van DNA vervuilt, deze reactie zal resulteren in geen band. Als de DNA-concentratie laag is, kan meer DNA worden toegevoegd aan elk reactievat, aanpassen van de hoeveelheid vrij Nuclease DDH 2 O gebruikt om het totale reactievolume van 50 pi brengen. Gebruik niet meer dan 5 ul DNA (10% het totale volume) per reaction kan mogelijk onzuiverheden in de DNA-monsters remmen PCR reacties. 6. PCR Fietsen Voer PCR amplificaties in een thermocycler uitgerust met een verwarmd deksel met behulp van de volgende PCR-fietsen parameters. We gebruiken de Mastercycle pro S thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) ingesteld om te werken met standaard temperatuur aanloop omstandigheden. Elke kwaliteit thermocycler moet goed te presteren. Cyclus Denaturatie Gloeien Polymerisatie 1 2 min bij 95 ° C 2 30 sec bij 95 ° C 30 sec bij 61 ° C 90 sec bij 68 ° C 35 cycli 3 5 min bij 68 ° C Houden op 4 ° C tot het monster wordt verwijderd </td> Optimaliseren voorwaarden voor PCR (inclusief primer hybridisatietemperatuur verlengingstijden, en het aantal cycli) nodig afhankelijk van de kwaliteit van het DNA primers Taq-polymerase of type thermocycler gebruikt. Aanbevolen om een gradiënt kan thermocycler het bepalen van de optimale gloeien temperaturen. Indien de thermocycler gebruikte niet verwarmd deksel voeg 1 druppel minerale olie de top van elk monster om verdamping gedurende PCR fietsen. 7. Gelelektroforese van PCR producten Om de resultaten van de analyse visualiseren afzonderlijke PCR producten op een 1% agarosegel volgens standaardprocedures elektroforese. Combineer 2 pi van een standaard DNA laadbuffer (typisch 5x of 6 oplossing) met 5 pi van elk PCR-product geamplificeerd. Plaats monster op een 1% agarose gel met EtBr (ethidiumbromide kleuring voor DNA) gemaakt either TAE of SB (natriumboraat) buffersystemen 16. We gebruiken 1 pi van een 10 mg / ml voorraadoplossing EtBr per 100 ml 1% agarose (0,1 ug / ml). Run monsters op ~ 120V tot de kleurstof voorkant bereikt ¾ van de totale lengte van de gel. Onder UV-licht (bijvoorbeeld een korte golf UV-licht doos), inspecteren de resulterende bands om te zien of een geschikt fragment was geamplificeerd. Documenteer de gel en de daaruit voortvloeiende banden met behulp van een beschikbare foto-documentatie van systeem of camera. 8. Representatieve resultaten Bij weergave van de PCR-producten, cogongrass een uniek strepen patroon ten opzichte van JBG of teruggezet JBG (figuur 5). Voor elk DNA-monster, moet de trnL-F positieve controle primerset resulteren in een hoge intensiteit band op ~ 890 bp. Dit wordt gecontroleerd of alle PCR-reagentia goed werken. Ook moet de negatieve controle (geen template) reactie bevatten geen banden voor een primer set gebruikt. Dit bevestigt dat geen van de reagentia werden besmet. Als het DNA monster afgeleid van wild-type cogongrass een PCR reactie met de cogongrass specifieke primerset resulteert in een band ~ 595 bp wanneer de JBG-specifieke primers, waardoor er geen band. Ook indien het DNA monster uit JBG of teruggekeerd JBG, een PCR reactie met de JBG specifieke primerset resulteren in een band ~ 594 bp wanneer de cogongrass-specifieke primers, waardoor er geen band. Omdat JBG en keerde JBG identieke nucleïnezuursequentie, zullen zij derhalve een identieke bandenpatronen. Als er veel monsters worden vergeleken een gel tegelijkertijd, raden lopen alle monsters afkomstig van elke primer naast elkaar zetten, waardoor het beter de monsters positieve resultaten scannen. Morfologische verschillen tussen JBG en JBG terug zijn vrij duidelijk (bijv. rode kleur van de bladeren en kleinere gestalte van JB G ten opzichte van de groene kleur, grotere gestalte en agressieve groei van het JBG terug), dus terwijl de PCR-resultaten zal hetzelfde zijn, de JBG rassen zijn gemakkelijk te onderscheiden met behulp van planten morfologie. Figuur 1. Vergelijking van de kas geteelde Imperata cylindrica var. Koenigii (Japans bloed gras), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Ongedaan maken) en I. cylindrica (wild-type cogongrass). Figuur 2. Een voorbeeld van DNA monsters gecontroleerd met een NanoDrop spectrofotometer. Merk op dat, ongeacht de gebruikte spectrofotometer, de 260/280 verhouding moet in de buurt van 1.8 en de 260/230 verhouding moet in de buurt van 2.0. NHOUD "> Figuur 3. DNA gecontroleerd met behulp van standaard gel elektroforese op een 1% agarose gel. Een commerciële DNA-merker werd gebruikt voor de grootte analyse. Lane 4 is een voorbeeld van slechte kwaliteit DNA monster met versmerings-en sommige RNA verontreiniging. Figuur 4. Volgorde uitlijningen van de trnL-F regio's van Imperata cylindrica var. Koenigii (Japans bloed gras), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Ongedaan maken) en I. cylindrica (wild-type cogongrass). Verticale zwarte pijlen geven de verschillen in sequenties als gevolg van SNPs en indels. Horizontale groene pijlen geven de posities van de Wild-type cogongrass primers gebruikt voor cogongrass-specifieke PCR. Horizontale rode pijlen geven de positions van de JBG en JBG Terugkeren primers gebruikt voor JBG-specifieke PCR. Figuur 5. Representatief resultaat van gelelektroforese van PCR-producten afgeleid van cogongrass, JBG en JBG terug DNA gecombineerd met cogongrass en JBG-specifieke primers en de trnL-F positieve controle en geen template negatieve controle.