Encapsulation של cardiomyocytes ב Hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב

1. בידוד cardiomyocyte ילודים – הכנה (יום לפני) פתרונות שנוצר בסעיף זה: PBS-גלוקוז הפתרון, להפסיק התקשורת. הכן פתרון PBS-גלוקוז ע"י הוספת 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין (100 יחידות / מ"ל ​​ו – 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​בהתאמה) ו 1.98 גרם של גלוקוז אל פוספט 1x 250 מ"ל סטרילי בופר סליין (PBS) ולהביא פתרון בנפח 500 מ"ל עם נוספים סטרילי 1x PBS. הכן להפסיק התקשורת על ידי הוספת 25 מ"ל FBS ו – 5 מ"ל של סטרפטומיצין, פניצילין (ריכוז כנ"ל) עד ​​בינוני השתנה 250 מ"ל סטרילי Dulbecco של הנשר (DMEM) ולהביא את נפח 500 מ"ל עם DMEM סטרילי לפני סינון סטרילי דרך 0.2 מיקרון המסנן. לעקר כלי ניתוח הדרושים בידוד ידי מעוקר: hemostat, # 5 מלקחיים, מספריים גדולים, מיקרו מספריים, וידית אזמל (# 4). 2. בידוד cardiomyocyte ילודים – הכנה (יום קציר) הקפד לשמור על סטריליות פתרונות השתמשו בסעיף זה: PBS-גלוקוז, בבטאדין פתרון במשך כל המלטה, לקחת את שני סטרילי 100 מ"מ בצלחות פטרי, למקם אותם מכסה המנוע להתמלא מ"ל 10 ~ של גלוקוז-PBS קר כקרח. אז אלו צריכים להיות ממוקמים בתוך דלי קרח מלא קרח מכסה את התרבות סטרילית. מניחים כוס 250 מ"ל עם 30-40 מ"ל של בבטאדין לתוך מכסה המנוע. הוסף 50 מ"ל / המלטה של ​​גלוקוז-PBS לתוך בקבוק חותם, ואת המקום לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. עבור כל אדם, מקום ספסל סופג underpad על משטח העבודה מכסה המנוע במקום לעטוף סטרילי על גבי נזהר שלא לגעת לעבוד במרכז שטח של הווילון הסטרילי. דאמפ מכשירי ניתוח וכן 4 X 4 תחבושת על וילון הסטרילי בלי לגעת במכשירים. פתח להב # 20 אזמל סטרילי dump על וילון, שוב נזהר שלא לגעת עם הלא סטרילית כפפות. קח את הגורים מן הסכר ואת המקום לתוך מיכל אטום, גורים מקום לתוך מכסה המנוע שים כפפות סטריליות מקפלים את גזה לתוך רבעים, מלחציים עם hemostat ומקום לתוך כוס בבטאדין. שים את להב סכין המנתחים בידית אזמל ומניחים בצד. 3. בידוד cardiomyocyte ילודים – דיסקציה לב פתרונות השתמשו בסעיף זה, בבטאדין PBS-גלוקוז פתרון תרימי את הגור ביד הלא דומיננטית על ידי העור צובט בין השכמות בין האגודל לאצבע המורה. בעזרת מספריים גדולים, לערוף את הגור בחיתוך אחד. הקפידו לחתוך מהחלק האחורי של קדימה הגור, כדי להבטיח את עמוד השדרה הוא ניתק לחלוטין. החזה ספוגית הגור של עם גזה בבטאדין ספוג. אבטח את הגור על ידי צובט השכמות יחד. ביצוע פתיחת בית החזה כדי לחשוף את חלקי הלב. הגדלת הלחץ המופעל, ובכך לאלץ את הלב בעבר צלעות לנתיחה scalpular. הפעל את הלהב אזמל מאחורי הלב לנתק את כלי נהדר ולהסיר את הלב. מניחים את הלב בצלחת פטרי המכילה גלוקוז-PBS כי הוא על הקרח. חזור על שלבים 1-3 עבור כל גור בבלגן. 4. בידוד cardiomyocyte ילודים – בידוד myocyte פתרונות נוצר / השתמשו בסעיף זה: PBS-גלוקוז, פתרון פתרון collagenase, להפסיק פתרון לאחר לבבות היו מבודדים, להסיר את כל שרידי דם ורקמות החיבור על ידי שטיפה ב קר כקרח פתרון PBS גלוקוז, להסיר את החלק העליון 1 / 3 של הלב על מנת לבודד רק את רקמת חדרית מקום לתוך צלחת פטרי עם טרי קר כקרח גלוקוז PBS, שהוכן קודם לכן. בזהירות לקצץ את ליבם אל ~ 1 מ"מ מעוקב באמצעות מיקרו מספריים מלקחיים. קחו להעביר פיפטה סטרילית, לחתוך את קצה באמצעות מספריים, כך הפה של פיפטה הוא ~ 3 מ"מ קוטר. השתמש פיפטה להעביר את פיסות רקמה וכל הפתרון לתוך 50 מ"ל חרוטי ומניחים על קרח. לשקול את 15,000 יחידות בכל המלטה של ​​גורים מסוג II collagenase (יחידות / מ"ג תלוי במגרש) ומקום לבקבוק של 37 ° C-PBS חימם גלוקוז מוכן קודם לכן ליצור פתרון collagenase. מערבבים היטב, לסנן לתוך בקבוק סטרילי נפרד. המקום חזרה לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מניחים את פתרון להפסיק לתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים גם כן. אפשר רקמות טחון ליישב לתחתית הצינור צנטריפוגות. הסר את supernatant עד נפח הכולל הוא ~ 10 מ"ל. הוסף 7 מ"ל של תמיסת collagenase אל הצינור צנטריפוגות. הכניסו את צינור חרוטי עם פיסות רקמות collagenase לתוך מתלה צינור על שייקר ההקפה בתוך 37 ° C חממה או בתנור. הפעל את שייקר מסלולית על בכ 60 סל"ד ולסגור את הדלת. הגדרת טיימר במשך 7 דקות. הקפידו למקם את BAC collagenasek לאמבטיה מים כדי לשמור אותו חם. כאשר השעון מצלצל, להחזיר את חרוטי לתוך מכסה המנוע. כמו כן להביא את collagenase חם להפסיק פתרון לתוך מכסה המנוע. לכיל בעדינות את חתיכות רקמה 5-7 פעמים כדי לשבור אותם. לאחר טיטרציה, לאפשר חתיכות כדי ליישב לתחתית (2-3 דקות). לשאוב משם כמה שיותר supernatant ככל האפשר נזהר מאוד לא למצוץ את פיסות רקמה. לאחר מכן, להוסיף 7 מ"ל של תמיסת collagenase את פיסות רקמות מקום בחזרה לתוך החממה על שייקר במשך 7 דקות. לכל שלב הנותרים, בעדינות לכיל 10 פעמים לשבור את פיסות רקמה. לאחר פיסות הרקמה להתיישב, לצייר את supernatant את ולאסוף אותו מ"ל 50 חרוטי נפרד. הוסף 7 מ"ל של collagenase את פיסות רקמות לעכל שוב במשך 7 דקות. כדי הצינור supernatant, להוסיף 10 מ"ל של תמיסת להפסיק עם טפטפת סרולוגיות שונות לאחר כל הוספה של supernatant מ העיכול. חזור על הפעולה עד שכל collagenase נעשה שימוש (7 צעדים בסך הכל). לאחר שלב העיכול הסופי, לקחת את חרוט עם פתרון התא ולסנן דרך מסננת לתוך תא 70μm חרוטי טריים. ספין התאים לעבר 100 גרם במשך 5 דקות ו resuspend ב 20 מ"ל של DMEM להימנות באמצעות hemocytometer, והמקום התאים על הקרח. מקום 50 μl של תאים לתוך פתרון Trypan כחול (75 μl Trypan כחול, 125 μl PBS), ומערבבים היטב לפני הצבת 10 μl ב hemocytometer עבור לספור. תאים חיים הם ברורים תוך התאים המתים כחולות. צפו כ -3 מיליון תאים לכל חולדה סיירים, עם יכולת הקיום של כ 80-90%. 5. יציקה הפיברין בונה ג'ל – הכנה ליצירת הפיברין ג'לים (כל הכבוד מראש) פתרונות שנוצר בסעיף זה: המניה פיברינוגן פתרון, פתרון תרומבין המניות, Pluronics פתרון, מדיה לבנות שריר הלב. הכן 33 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות של פיברינוגן במאגר 20 מ"מ HEPES ב 0.9% מלוחים ידי פיברינוגן ערבוב לאט לתוך HEPES שנאגרו מלוחים לאורך מספר שעות ב 37 ° C. אפשר פתרון ליישב בין לילה ב 2-8 ° C. חם הפתרון 37 ° C. הפתרון הוא סינון סטרילי דרך סדרה של מסננים ברציפות: תא 40 מיקרומטר מסננות, בקבוק 0.45 מיקרומטר מסננים העליונה עם זכוכית טרום מסננים, בקבוק 0.2 מיקרומטר מסננים העליונה עם זכוכית טרום מסננים. הפתרון הוא aliquoted לתוך מ"ל 1 ו -3 aliquots מ"ל ומאוחסנים ב -20 ° C. הכן 25 U / mL פתרון המניות של תרומבין על ידי הוספת 500 U של תרומבין על 18 מ"ל של תמיסת מלח 0.9% ו – 2 מ"ל של מים deionized סטרילי, מסנן סטרילי דרך aliquot, 0.2 מיקרומטר לסנן לתוך μl 500 ו – 250 μl aliquots ולהקפיא בבית -80 ° C. הכינו 5% w / v Pluronics F-127 פתרון, על ידי המסת 50 גרם של Pluronics F-127 עד 700 מ"ל מים deionized. תביאו נפח פתרון עד 1 ליטר מים deionized נוספים. סינון סטרילי עם מסנן 0.2 מיקרומטר. הפתרון Pluronics יכול לשמש עד שלוש פעמים לפני החלפת אם סטרילי מסונן לאחר כל שימוש. הכן לבבי לבנות מדיה ידי הוספת סוס בסרום של 10%, 2% בסרום שור עוברית, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, 6 מ"ג / מ"ל, aminocaproic חומצה לתוך DMEM. 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של חומצה אסקורבית ו 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אינסולין 25 מיקרומטר HEPES צורך להוסיף מיד לפני האכלה. להרכיב mandrel ידי הצבת אחד ביחד מוט טפלון, אחת שרוול טפלון, שתי דיסקיות טפלון עם חריץ הוסרו לצורך הזרקה, ושני גומי טבעות אטימה (ראה איור 2 א). החיטוי לפני השימוש. קח תרמילי מזרק 6cc עבור החלק החיצוני של התבנית ואת תרמילי מזרק 3cc לשמש בוכנות, ולהכינם ידי ניתוק luer נעילת מסתיים מעוקר (ראה איור 2 א). 6. יציקה הפיברין בונה ג'ל – לקראת יצירת ג'לים הפיברין (מימין לפני ביצוע בונה ג'ל הפיברין) פתרונות השתמשו בסעיף זה: פתרון Pluronics סינון סטרילי Pluronics 5% F-127 פתרון עם 0.2 מיקרומטר לסנן לפני השימוש. המקום mandrels ואת תרמילי מזרק לתוך פתרון Pluronics 5% 1 כוס L בשכונה. השאירו את החלקים השריה בתמיסה Pluronics עבור 2-3 שעות למכסה המנוע, כדי להבטיח ציפוי להשלים. הפתרון Pluronics המעילים mandrels ומונע את הג'ל הפיברין מתוך דבקות mandrels. לאחר דגירה 2-3 שעות, לשפוך את הפתרון של 5% Pluronics בחזרה לתוך הבקבוק, מקום סטרילי וילונות מטה על פני השטח של מכסה המנוע ללבוש כפפות סטריליות לבנות את תבניות. מניחים את mandrels נבנה לתוך מזרק 6 תרמילי סמ"ק, באמצעות מזרק 3cc כמו הבוכנה כדי להבטיח חותם הדוק בין O-טבעות דיסקיות טפלון. 7. יציקה הפיברין ג'ל בונה באמצעות הזרקה פתרונות שנוצר בסעיף זה: פתרון F, T פתרון, פתרון התא. כדי להפוך 1 מ"ל של ג'ל הפיברין (3.3 מ"ג / מ"ל ​​ריכוז פיברינוגן הסופי, 25 U / mL הריכוז הסופי תרומבין), ליצור F פתרון צינור חרוטי, על ידי הוספת 112 μl של המניה ל פיברינוגן 558 μl של הצפת 20 מ"מ HEPES ב תמיסת מלח 0.9%. בתוך צינור חרוטי נפרד, ליצור פתרון T על ידי הוספת 17 μl של המניה תרומבין, ו 1.3 μl של 2 N Ca + + פתרון μl 135 של DMEM. ראה לוח 1. בתוך צינור חרוטי שלישי, להכין פתרון התא על ידי ספינינג את התאים resuspending התאים נפח, כך הריכוז של התא הוא 29,400,000 תאים / מ"ל ​​או 6 פעמים ריכוז ריכוז הסופית הרצויה של תאים לבנות את כאשר אתה מוכן להטיל את הג'ל הפיברין לבנות, הכנה מזרק 1 מ"ל עם מחט 18G ½ 1 ס"מ ארוך. האם מחט 21G 1 אינץ מוכן גם כן. הפתרון הפיברין נוצר על יחס 04:01:01 של פתרון פריץ: פתרון T: פתרון התא. כדי לעשות אחד מ"ל של ג'ל, להוסיף 667 μL של פתרון F לתוך צינור צנטריפוגות נקי של 50 מ"ל, ואחריו μL 167 הפתרון הנייד, ולבסוף להוסיף 167 μl של פתרון טי. פיפטה לערבב פתרון יחד נזהרים שלא להציג בועות. ברגע פתרונות מעורבבים, התגובה החלה את הזריקה של בונה את צריכה להיעשות באופן מיידי. קח את המזרק מוכן בעבר עם מחט 18G ו להכין פתרון הפיברין. יש להיזהר שלא להפוך את המזרק כדי למנוע בועות להגיע אל המחט. החלפת מחט 18G עם מחט 21G. הקש על המזרק בעדינות כדי להוציא בועות אוויר. הכנס מזרק לתוך תבנית בין הפקק לבין מעטפת הבאים החריץ של טפלון O-Ring ו להזריק את הפתרון לתוך התבנית. הטו את התבנית עם החריץ על גבי כדי להבטיח מילוי מלא. הסר את המזרק ולהמשיך למלא תבניות הנותרים. הפתרון ג'ל מספיק ניתן ליצור למלא תבניות מספר באותו זמן. עם זאת, כי הפתרון ג'ל מהר, זה בדרך כלל מומלץ להגביל את מספר המבנים מוזרק בכל זמן נתון עד 6. עטפו את תבניות ב Parafilm בקבוצות של שלושה ומקום בחממה או בתנור על 37 ° C. אפשר הג'לים כדי לדגור על תבניות במשך 20 דקות כדי לאפשר זמן ג'ל כדי לפלמר. ממלאים כל צנצנת תרבות (Nalgene ישר בצד צנצנת) עם 21 מ"ל של מדיום לבנות שריר הלב לכל לבנות. השתמש במזרק סטרילי 3 סמ"ק מעטפת כמו הבוכנה לכוח mandrel עם הקמת לתוך צלחת פטרי גדולה עם DMEM. אז במקום לבנות לצנצנת הדגימה. כל צנצנת 16 גרם יכול להחזיק עד 6 בונה, בעוד כל צנצנת 4 גרם יכול להחזיק 2. בורג כמוסות על הצנצנות ולהעבירם החממה. בתוך האינקובטור, לשחרר את כובעי על הצנצנות כדי לאפשר חילוף הגזים. לאחר 24 שעות, לקחת לאסוף שיניים סטרילית לדחוף את לבנות הרחק טפלון לבן O-טבעות על קצות עובש את הטבעת על מנת להבטיח יישור אחיד של לבנות (ראה תרשים 2 בתוצאות נציג). 8. ניתוח טכניקות (לאחר 2 שבועות בתרבות) – כוח בדיקות התכווצות פתרונות השתמשו בסעיף זה: DMEM, לבבי לבנות התקשורת. קלאמפ קליפים תנין על להוביל את המגיע ממריץ אל חוטי על האלקטרודות באמבטיה. כוח מעלה הלוח רכישת נתונים, גנרטור הדופק, ואת מתמר כוח. מתמר כוח צריך להיות מופעל להגדרה 5g ו מאופס. פתח תוכנית אישית LabVIEW המציג ושומר את הנתונים מתמר כוח. יצירת קובץ חדש, טקסט ריק בתיקייה נתונים עבור כל דגימה. המקום DMEM לתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים ולאפשר זמן לזה להתחמם לפני בדיקת בונה. חימם פעם, מקום 37 ° C DMEM לאמבטיה בינוני של מערכת מדידה כוח (ראה איור 3A). הסר את לבנות מצנצנת המדגם על ידי הזזה בעדינות את הטבעת לבנות מתמיכה טפלון עם פינצטה והמקום לבנות על הפוסט מתכת קבוע בתוך אמבט למדידת כוח במערכת בינוני. אין אחיזה לבנות עם פינצטה! במקום זאת, להשתמש בפינצטה כדי לדחוף ולהרים את לבנות את התמיכה mandrel. מניחים את הקצה השני של לבנות את הזרוע מעל מתמר והדק עד מתמר קורא 0.50V, (כ 1.0 גרם בכוח או 10 millinewtons מתח) בחר את קובץ הטקסט עבור חיל נתונים התכווצות שיירשמו אל. ביום ממריץ הלב (דגם # S88X, טכנולוגיות דשא), להגדיר את הדופק כדי מתח 20V (8 V / cm), משך 6ms, ושיעור של 1 הרץ. הפעל את צעדה חשמלי על ידי לחיצה על "פלט on / off" כפתור התחל הקלטה עד waveform הופך קבוע. הסר בזהירות את לבנות מן אמבט למדידת כוח במערכת בינוני ולמקם אותו בחזרה בינוני תרבות. ואז להסיר את DMEM מן האמבט מערכת מדידה כוח בינוני להחליף עם טרי, חם DMEM לנתח additדגימות לאומיים. חותכים את לבנות ולפרוש אותו, כך שאתה יכול למדוד את אורך ורוחב של לבנות את חותכים את לבנות למקטעים כדי לשמש למדידות נוספות כולל ניתוח כדאיות, היסטולוגיה, או מדידות כתם המערבי. 9. ניתוח טכניקות (לאחר 2 שבועות בתרבות) – Live-המלח Assay עבור הכדאיות (עם Assay Live / Dead Invitrogen) 14: פתרונות השתמשו בסעיף זה: EthD-1 פתרון המניות, calcein AM מניות פתרון PBS לשטוף עם דגימות שוטף 5 דקות 3x ב PBS. הוסף 20 μl של 2 מ"מ EthD-1 פתרון המניות של 10 מ"ל סטרילי PBS ו מערבולת כדי להבטיח ערבוב יסודי. הוסף μl 5 מ"מ 4 calcein AM stolution מניות לפתרון EthD-1. שוב, מערבולת כדי להבטיח ערבוב יסודי. הוספת נפח מספיק של הפתרון לעיל כדי לכסות את לבנות. דגירה מכוסה (כדי למנוע photobleaching של צבעים) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את צובעת ולהחליף PBS חם. לצפות ולהקליט תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Calcein הוא נרגש על ידי אור 494 ננומטר ופולט אור 517 ננומטר, בעוד ethidium homodimer-1 הוא על ידי האור 528 ננומטר ופולט אור 617 ננומטר. ראה איור 4 תוצאות המדגם. 10. ניתוח טכניקות (לאחר 2 שבועות בתרבות) – אימונוהיסטוכימיה עבור חלבונים myocyte חשובים: פתרונות השתמשו בסעיף זה: PBS, paraformadehyde 4% ב-PBS, סרום חמור 5% ב-PBS, נוגדנים PBS, 0.1 ng / mL Hoechst 33258 ב PBS. לשטוף עם דגימות שוטף 5 דקות 3x ב PBS. תקן עם paraformaldehyde 4% פתרון PBS, במשך 2-3 שעות 4 ° C לשטוף עם דגימות שוטף 5 דקות 3x ב PBS. המדגם יכול להיות מוטבע, מחולק ומוכתמת לפי הפרוטוקול של בחירה. החלק הנותר של פרוטוקול זה מכסה מכתים לבנות עבור כל הדמיה עם מיקרוסקופיה confocal. שים לב כי פעמים הדגירה הם יותר כי רקמת מחולק כמו שיש צריך להיות יותר זמן הנוגדנים לנטרל לתוך לבנות. בנוסף, כל השלבים הנותרים מתנהלים בטמפרטורת החדר. הוסף 0.1% Triton-X ב PBS על דגימות במשך 30 דקות כדי permeabilize את ממברנות התאים. שוטפים את דגימות עם שוטף 10 דקות 3x ב PBS. הוסף בסרום חמור של 5% PBS על דגימות 1 שעות וחצי כדי לחסום כל מחייב הלא ספציפית של הנוגדן משני המדגמים. הוסף Connexin 43 (01:50 דילול) ואת שרשרת שרירן כבד (1:100 דילול) נוגדנים העיקרי PBS על דגימות במשך 3 שעות. כדי תווית הן חלבונים ברציפות עליך לוודא כי נוגדנים העיקריים הם מהמארחים שונים (כלומר ארנב ועכבר). שוטפים את דגימות עם שוטף 10 דקות 3x ב PBS. הוסף את הנוגדנים המתאימים משני שכותרתו fluorescently ב PBS במשך 3 שעות. שוטפים את דגימות עם שוטף 10 דקות 3x ב PBS רגע לפני הדמיה דגימות על מיקרוסקופ confocal, להוסיף 0.1 ng / ml Hoechst 33258 ב PBS במשך 15 דקות. שוטפים את דגימות עם שוטף 10 דקות 3x ב PBS. ניתוח ביטוי דגימות של MHC ו Cx43 ידי התאים דימות באמצעות מיקרוסקופ confocal (ראה תרשים 4 לתוצאה למשל). 11. נציג / תוצאות תוצאות: Cardiomyocyte הפיברין לבנות תחילה מכסה את כל רוחב של עובש (2B איור). בועות לא צריך להתקיים לבנות ואת זה צריך להיראות אחיד לאורך כל אורכו. אחרי שבועיים של culturing, חוזה לבניית כ 1 / 4 של רוחב הראשוני (איור 2C). כאשר היא לבנות בקצב חשמלית ב אישית למכשיר שלנו בכוח התכווצות (איור 3A), חיל נתונים עווית יכול להיווצר כפי שמוצג באיור 3 ב. Waveform ניתן לנתח בנפרד MATLAB (MathWorks) כדי לקבוע את הכוח, שיעור התכווצות, ושיעור הרפיה. כוחות עווית של כ 1.3 MN צפויים 6. הכדאיות של הקמת תא תלוי בעומק לבנות, בשל מגבלות דיפוזיה של חמצן לתוך לבנות. על פני השטח של לבנות, תרשים 4 א, כדאיות התא גבוה הוא ציין. עם מיקרוסקופיה confocal, איור 4B, המבנה מיושר של לבנות את הוא ציין בשל שרשרת שרירן כבד, MHC, חשוב התכווצות, באדום. Connexin 43, המוצג ירוק, הוא הכרחי עבור צימוד בין myocytes הסלולר. איור 1: סקירה כללית של תהליך אנקפסולציה איור 2: א) חלקים עובש נפרדת בשילוב ליצירת ג'ל הפיברין. הלוך ושובמ 'משמאל לימין: שני מנקי טפלון, שני סיליקון O-טבעות, מוט טפלון, צינור טפלון, mandrel הושלמה, מעטפת חיצונית עבור mandrel, ואת הבוכנה). ב) בנה על עובש מיד לאחר פליטה מן מעטפת החיצונית (יום 0). ג) לבנות דחוסות על עובש (חץ אדום), לאחר 13 ימים של תרבות. איור 3: א) צמצום כוח מותאם אישית מדידה מערכת כוח עווית ההקלטה. מתמר כוח עם לכתוב מודד את כוח התכווצות ופלט את התוצאות למחשב. אמבט המכיל שתי אלקטרודות פחמן עם חוטים מתחבר גירוי חשמלי אשר צעדים לבנות. שתי ההודעות להחזיק לבנות במקום. ב) עווית לדוגמא כוח waveform נתונים שנוצר עם גירוי חשמלי ב 0.5 הרץ. איור 4: assay) Live / Dead של לבנות, יום 13 (בר בקנה מידה = 400 מיקרומטר). הירוק מייצג את תאים חיים אדום מייצג את התאים המתים. ב) תמונה Confocal שרשרת שרירן כבד (אדום), Connexin 43 (ירוק) Hoescht גרעיני כתם (כחול) (בר בקנה מידה = 10 מיקרומטר). F פתרון T פתרון תא פתרון פיברינוגן 112 μl טרומבין 17 μl תאים DMEM Μl 170 HEPES 558μl Ca + + Μl 1.3 DMEM 152 μl סך הכל 670 μl סך הכל Μl 170 סך הכל Μl 170 1. טבלת הפיברין פתרונות ג'ל, כמויות של 1 מ"ל של ג'ל. הערה: פיברינוגן = 33 מ"ג / מ"ל ​​פיברינוגן ב 20 mM HEPES שנאגרו מלוחים HEPES = 20 mM HEPES שנאגרו מלוחים טרומבין = 25 U / mL פתרון פתרון 0.81% NaCl Ca + + N = 2 סידן כלוריד פתרון