Imaging adesione dei leucociti all'endotelio vascolare ad alta pressione intraluminale
Summary
Questo è un metodo per visualizzare l'adesione dei leucociti all'endotelio in raccolte serbatoi in pressione. La tecnica consente di studiare l'adesione vascolare in condizioni di flusso di taglio con differenti pressioni intraluminali fino a 200 mmHg così imitare-zione le condizioni fisiopatologiche di alta pressione sanguigna.
Abstract
In tutto il mondo, l'ipertensione è segnalato per essere in circa un quarto della popolazione ed è il fattore principale di rischio biomedici per la mortalità a livello mondiale. Nella ipertensione vascolare è associata a disfunzione endoteliale e l'infiammazione che porta a una maggiore aterosclerosi e patologie diverse come la malattia renale cronica 2, 3, ictus e scompenso cardiaco 4. Un primo passo nel processo infiammatorio vascolari che determinano l'aterogenesi è la cascata di adesione che prevede la laminazione, tethering, aderenza e conseguente trasmigrazione dei leucociti attraverso l'endotelio. Reclutamento e l'accumulo dei leucociti all'endotelio è mediata da un sovraregolazione delle molecole di adesione come la molecola di adesione delle cellule vascolari-1 (VCAM-1), l'adesione cellulare molecola intracellulare-1 (ICAM-1) ed E-selectina così come gli aumenti in rilascio di citochine e chemochine e una sovraregolazione di specie reattive dell'ossigeno 5. Metodi in vitro come test adesione statica aiutare a determinare i meccanismi coinvolti nella cellula-cellula l'adesione, nonché l'analisi delle molecole di adesione delle cellule. Metodi utilizzati in precedenti studi in vitro hanno dimostrato che un aumento acuto della pressione sul endotelio può portare ad adesione dei monociti, un sovraregolazione di molecole di adesione e marker infiammatori 6 Tuttavia, simile a molti test in vitro, questi risultati non sono stati eseguiti in tempo reale in condizioni di flusso fisiologico, né con sangue intero. Pertanto, in vivo sono sempre più utilizzati in modelli animali per dimostrare l'infiammazione vascolare e lo sviluppo della placca. Microscopia intravitale è ora ampiamente utilizzato per valutare l'adesione dei leucociti, lamiere, migrazione e trasmigrazione 7-9. Quando si combinano gli effetti della pressione sui leucociti per l'adesione endoteliale studi in vivo sono meno estese. Uno di questi studi prende in esame gli effetti in tempo reale del flusso di taglio e sulla crescita arteriosa e marker infiammatori rimodellamento, ma sono stati valutati solo attraverso immunoistochimica 10. Qui vi presentiamo un modello per la registrazione di adesione dei leucociti in tempo reale intatta vasi sanguigni sotto pressione, utilizzando la perfusione di sangue intero. La metodologia è una modifica di un modello di nave ex camera di perfusione in vivo 9 che permette analisi in tempo reale delle interazioni leucociti-endotelio adesivo in vasi intatte. La nostra modifica consente la manipolazione della pressione intraluminale fino a 200 mmHg consentendo lo studio non solo in condizioni di flusso fisiologico ma anche condizioni di pressione. Mentre i sistemi myography pressione sono state precedentemente dimostrato di osservare nave parete e lume diametro 11 così come la contrazione nave questa è la prima volta dimostrando leucociti-endotelio interazioni in tempo reale. Qui mostriamo la tecnica utilizzando carotidi raccolti da ratti e cannulata ad una misura camera di flusso accoppiato ad un microscopio a fluorescenza. La camera di imbarcazione è equipaggiata con il coprioggetti fondo permettendo una grande lente di grande diametro obiettivo a breve distanza di lavoro per l'immagine della nave. Inoltre, agonista selezionati e / o antagonisti può essere utilizzata per approfondire i meccanismi che controllano l'adesione cellulare. I vantaggi di questo metodo rispetto microscopia intravitale includono alcun coinvolgimento di un intervento chirurgico invasivo e quindi un throughput più elevato può essere ottenuto. Questo metodo consente anche l'utilizzo di inibitori della localizzato l'imbarcazione desiderata mentre intravitale consente solo trattamento sistemico inibitore.
Protocol
Discussion
Si tratta di un metodo modificato per studiare l'adesione dei leucociti all'endotelio in intatti i vasi sanguigni isolato in condizioni di pressione in tempo reale. Perfusione della camera solo recipiente consente una rapida convalida dei pro-infiammatorie ceppi di topi e grandi vasi di ratto. L'attivazione consente la manipolazione di pressione dinamica delle interazioni delle cellule che devono essere osservati dal basso verso l'intraluminale pressioni molto elevate, quindi meglio imitare-mento fisiologico e condizioni fisiopatologiche. Diametro dei vasi può essere misurata con un sufficiente cellulare imaging programma e quindi il flusso di taglio e la velocità può essere determinato e quindi manipolata.
Con le sue capacità miografo, interventi farmacologici nel bagno aggiungere un'altra dimensione alle condizioni sperimentali possibile con questo modello che permette studi meccanicistici e dei percorsi di segnalazione. Mentre la conservazione endoteliali non può essere confermata durante la manipolazione di pressione, le risposte a ACh e PE può essere condotta perfusione post 9.
Va notato che questa impostazione dimostra gli effetti della pressione intraluminale sulla cellula-cellula non interazioni gli effetti del flusso ematico pulsatile né sistolica o diastolica. Inoltre, mentre le variazioni di pressione acuta sulla adesione dei leucociti sono stati osservati, questa configurazione può essere utilizzata anche per guardare gli effetti della pressione cronica (cioè aumentando i tempi di incubazione e utilizzando un modello animale cronico di pressione). Sprague Dawley arterie carotidi comuni sono dimostrate in questo set up, ma altri ceppi e le specie possono essere utilizzati con gli opportuni adeguamenti alle dimensioni cannula. Infatti, è importante notare che l'età e il peso degli animali sulle dimensioni del vaso e quindi che il set up deve essere personalizzato per ciascuna nave. Dissezione stretta e attenta del tessuto connettivo in grado di migliorare la visualizzazione dei leucociti immensamente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto in parte dal Programma OIS del Governo del Victoria, il National Health and Medical Research Council of Australia borse di programmi e progetti (JPF Chin-spolverare) e borsa di studio post-laurea (D Michell).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
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