Изображений адгезии лейкоцитов к эндотелия сосудов при высоких внутрипросветного давления
Summary
Это метод для визуализации адгезии лейкоцитов к эндотелию в заготовленных под давлением. Техника позволяет изучать сосудистой адгезии при сдвиге потоков с различными внутрипросветного давления до 200 мм рт.ст. Таким образом имитировать-ING патофизиологических условиях высокого кровяного давления.
Abstract
Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.
Protocol
Discussion
Это модифицированный метод изучения адгезии лейкоцитов к эндотелию в интактных изолированных кровеносных сосудов под давлением условиях в реальном времени. Перфузии судна камеры только позволяет быстро проверки провоспалительных штаммов больших мышей и крыс судов. Включение давление манипуляции обеспечивает динамическое взаимодействие ячейки, которые должны соблюдаться от низких до очень высоких внутрипросветного давления, тем самым лучше имитировать ING-физиологических и патофизиологических условиях. Диаметр суда также может быть измерена с помощью достаточного клеточной визуализации программы и, следовательно, сдвигового течения и скорость может быть определена и, следовательно, манипулировать.
С его возможностями myograph, фармакологических вмешательств помещен в ванну добавить новое измерение в экспериментальных условиях возможно с этой модели позволяют исследовать механистического и сигнальных путей. Хотя эндотелиальные сохранения не могут быть подтверждены в ходе манипуляции давления, реакции на АХ и PE может быть проведена после перфузии 9.
Следует отметить, что эта установка демонстрирует последствия внутрипросветного давления на клетки к межклеточных взаимодействий не эффект пульсирующего потока крови, ни систолического и диастолического давления. Кроме того, в то время как резкие изменения давления на адгезии лейкоцитов наблюдалось, эта установка может быть также использована, чтобы смотреть на хроническое воздействие давления (т.е. увеличение времени инкубации и использовании модели хронического животных давления). Sprague Dawley общей сонной артерии, продемонстрированный в этом созданы, но и другие штаммы и виды могут быть использованы с соответствующей корректировки размера канюли. В самом деле, важно отметить, что возраст и вес животных влияет на размер судна и, таким образом, что создали должно быть индивидуальным для каждого судна. Закрыть и тщательного вскрытия соединительной ткани может улучшить визуализацию лейкоцитов безмерно.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано частично OIS викторианской правительством программы, национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии программ и проектов, грантов (ССПМ Чин-Удаление пыли) и аспирантов стипендии (D Мичелл).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 .
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
