高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

1。頸動脈を分離 CO 2 / O 2窒息経由Euthanase10週齢のSprague Dawleyラット。 最小限の血管の伸縮性を確保大動脈、心臓と消費税の左と右の総頸動脈。 氷冷クレブス緩衝液中で大動脈と心臓から頚動脈を分離し、緊密な解剖を行う。 マウントする前に氷上でクレブスで孤立した血管を保つ。 約。時間= 45分 2。プライミング容器室 37バッファを介し℃、carbogenガス（5％CO 2 95％O 2）を導入することで、生理的pHに維持血管チャンバーフラッシュクレブスバッファーの近位および遠位のコネクタでチューブやカニューレが完全にフラッシュされると、整列されていることを確認します。 P1（近位）とP2（遠位）変換器を介してクレブスバッファーをフラッシュします。トランスデューサには、気泡のないことを確認するためにタップを閉じます。 対応するコネクタにトランスデューサを接続し、再び空気の泡を確実にない、よりクレブスバッファーをフラッシュします。チャンバーにタップをオフに閉じてください。 約。時間= 15分 3。血管の加圧室圧力機器の電源をオンにします。圧力サーボ、圧力モニター、蠕動ポンプ（図1）。 圧力は20 mmHgの（1のダイヤル）でチューブを介して自動実行クレブス緩衝液の圧力のサーボで蠕動ポンプと、空気の泡を保証しません。 閉じたP2トランスデューサにチューブを接続します。圧力が安定になります。 どんな泡を吐き出すのに血管チャンバーにP2のタップを開くには、その後オフ閉じます。 クレブスバッファー（ – 7 mLの5）と風呂を埋める。 約。時間= 10分 4。容器の取り付け各カニューレ上に解剖顕微鏡の代わりに黒のポリエステルネクタイ（図2）に基づく。 離れてカニューレとカニューレホルダーを移動して、P1のカニューレ上にマウント¼容器（大動脈弓の端）。容器を引き裂くしないことを確認します。 クレブス緩衝液で満たされた注射器を使用すると、静かにP1のトランスデューサーを介して血管の過剰な血液を洗い流す。チャンバーにP1をオフに閉じます。 ポリエステルのネクタイとP1のカニューレに安全な容器。 P2カニューレに取り付けるためのカニューレ/近いカニューレホルダーを移動します。 遠位カニューレに容器の先端を（〜¼長さの）マウントします。ポリエステルタイで固定します。 約。時間= 20分 5。容器を加圧容器内に曲げたり、ストレッチを確保しないようにカニューレホルダーを調整します。 P1とP2は、チャンバーに閉じた状態で自動から手動に圧力サーボを切り替えます。 10秒内の圧力の継続的な低下が存在しない圧力のサーボを確認してください。ある場合は、リークが発生している接続と変換器は、所定位置に固定する必要があります。 チャンバーへの自動その後オープンP2に背圧サーボを調整します。顕微鏡下でタップをチャンバーに開いたときに血管が拡張させ観察。 マニュアルに圧力のサーボを切り替えます。 10秒内の圧力の継続的な低下のためにもう一度確認してください。漏れがある場合、システムはタイトな圧力と容器内の穴になる可能性がありますされていません。 チャンバーに自動オープンP1に切り替えます。手動設定で圧力が安定していることを確認してください。 ない漏れの場合、手動設定の増加ダイヤルの2（40 mmHgの）へ。 自動に調整し、顕微鏡下で血管を観察。必要に応じて、手動設定に漏れがないvessel.Checkには曲がりのないことを確認するためカニューレホルダーを調整する。 5.7所望の圧力に到達するまでに、3（60 mmHgの）を4（80 mmHgの）などのダイヤルを増やす – 手順5.6を繰り返します。 約。時間= 15〜30分 6。加圧容器をインキュベート 37温度コントローラセットを接続℃を血管室バスへの2番目の蠕動ポンプ散らすクレブス緩衝液（1 mL /分）で。 バスの唯一の最上位層が除去されることを保証室にアスピレータを接続します。 自動に設定された圧力で1時間、37℃で加圧された容器をインキュベートする。 圧力が定期的に（手動への切り替え）漏洩されていません確認してください。 様々な薬理学的介入の効果は、単にインキュベーション中にお風呂に化合物を添加することによって観察することができます。 約。時間= 1時間 7。全血と加圧容器を灌流インキュベーション中に少なくとも7.5 mLのヒト全血/ 40 Uのヘパリン/ mLの血液中に収集された容器を得る。 37℃で50mlファルコンでインキュベート℃の tの最後の10分前37彼10分間VybrantDil（1:1000）とインキュベーションのラベルの血·ダークのC。 10分後、気泡をクリアシリンジで血液を収集し、37℃で設定されたヒートジャケット℃でシリンジポンプに取り付けて室/容器にP1のトランスデューサをオフに閉じ、シリンジと廃液チューブを接続する。 任意の気泡を除去するため廃液チューブを介して1000μL/ minでパージの血液。 チャンバーにP1を開きます。圧力のサーボは、所望の圧力を維持するために自動的に調整されます。 100μL/ minの血液を灌流。 デジタルカメラのレコード1で15秒間灌流血管の2つのフィールド、3、5、7.5および10分に結合蛍光顕微鏡を使用する。 郵便灌流血管内皮の完全性と機能がさらに炎症反応を検証するために免疫組織化学によって決定することができるようミオグラフと接着分子の発現などの薬理学的技術を介して評価することができる。 約。時間= 15分 8。代表的な結果： 圧力室のセットアップの概略図を図1に示されています。と蛍光顕微鏡の結果に結合デジタルカメラは、ライブビデオの録画を経由して瞬時に視覚化することができます。代表的なビデオ画像は、白血球が、彼 ​​らが10秒間静止残った場合内皮に付着すると考えられる図3に見られている。連続ループ接着細胞でのビデオ録画とフィールド当たりの平均としてカウントすることができます。低い（ 図3A）と高い（ 図3B）圧力の両方に密着性のある量の高い管腔内圧における白血球接着の顕著な増加を引き起こすだろうが見られ、これはまた、（ 図4）定量的に実証される。 図1。加圧ex vivoでの血管チャンバー概略図。近（P1）変換器と血圧が容器内で操作できるようにする、遠位（P2）変換器に接続されているカニューレ容器。灌流は、P1のトランスデューサーを介して、圧力はP2変換器を介して維持されます。 図2。タイでCannuala。黒いポリエステルのネクタイは、各カニューレに接続されています。 図3。灌流の10分後の代表的なビデオ画像を 80 mmHgの（）で蛍光下。ダイナミック細胞接着（赤矢印）、120 mmHgの（B）。 図4。低い（80 mmHgの）と高圧（120 mmHgの）で1時間のインキュベーション後のSprague Dawleyラット頸動脈の動脈における白血球接着。 *** P <0.001、としてBonferroniの事後検定を用いて2方向反復測定ANOVAで分析した。