Adhésion leucocytaire imagerie de l'endothélium vasculaire au Haute pression intraluminale

1. Isoler les artères carotides Euthanase10 semaine anciens rats Sprague-Dawley par l'intermédiaire de CO 2 / O 2 asphyxie. Accise gauche et à droite des artères carotides communes avec l'aorte et le coeur assurant un minimum d'étirement des vaisseaux. En glacée tampon Krebs séparer les artères carotides de l'aorte et le coeur et effectuer la dissection proche. Gardez les bateaux isolés dans Krebs sur la glace avant le montage. Env. temps = 45 min 2. Amorçage de la chambre de cuve Au connecteurs proximales et distales de la chambre de cuve affleurant tampon Krebs maintenue à pH physiologique en infusant de gaz carbogène (95% d'O 2, 5% CO 2) grâce à la mémoire tampon à 37 ° C. Assurez-tubes et canules sont vidées complètement et sont alignés. Rincer tampon Krebs par la P1 (proximale) et P2 (distale) transducteurs. Fermer les robinets afin de s'assurer qu'aucune bulle d'air dans les transducteurs. Connectez les capteurs aux connecteurs correspondants et encore plus ras tampon Krebs assurant aucune bulle d'air. Fermer les robinets de la chambre. Env. temps = 15 minutes 3. Pressurisation de la chambre de cuve Allumez l'équipement sous pression: la pression d'asservissement, de contrôler la pression, pompe péristaltique (Figure 1). Avec la pompe péristaltique sur la pression et la pression sur les servo-automatiques fonctionner tampon Krebs à travers le tube à 20 mmHg (cadran à 1), garantissant aucune bulle d'air. Relier les tubes du capteur P2 fermé. La pression sera devenue stable. Ouvrir le robinet de P2 à la chambre des navires pour évacuer les bulles, puis fermer. Remplissez le bain avec tampon de Krebs (5 – 7 ml). Env. temps = 10 min 4. Montage du navire En vertu d'une dissection liens endroit en polyester noir sur microscope à chaque canule (figure 2). Déplacer les canules et les détenteurs de la canule en dehors et monter des navires (¼ arc aortique fin) sur la canule P1. Assurez-vous de ne pas déchirer le navire. En utilisant une seringue remplie de tampon Krebs doucement rincer l'excès de sang hors de la cuve par sonde P1. Fermez P1 à la chambre. Navire sécurisé à la canule P1 avec la cravate en polyester. Déplacer canules / détenteurs canule plus pour le montage sur la canule P2. Mont extrémité distale du vaisseau (~ ¼ de la longueur) sur la canule distale. Fixez avec cravate en polyester. Env. temps = 20 min 5. Pressurisation du navire Ajuster les détenteurs canule afin de s'assurer qu'aucun plier ou étirer dans le vaisseau. Avec P1 et P2 fermée de la chambre de changer le servo de pression automatique au mode manuel. Vérifiez la pression sur le servo il n'ya pas de baisse continue de la pression dans les 10 secondes. S'il ya une fuite se produit et les connexions et les capteurs doivent être fixés en place. Ajuster le servo-pression à P2 puis ouvrez automatique à la Chambre. Sous le microscope, d'observer le navire se dilatent lorsque le robinet est ouvert à la chambre. Mettre le servo pression manuelle. Encore une fois vérifier diminution continuelle de la pression dans les 10 secondes. S'il ya une fuite, alors le système n'est pas étanche à la pression et il est susceptible d'être un trou dans le bateau. Revenez à P1 ouverte automatiquement à la chambre. Sur le réglage manuel vérifier que la pression reste stable. Si aucune fuite, sur le cadran de réglage manuel pour augmenter 2 (40 mmHg). Régler sur automatique et d'observer le navire sous le microscope. Si nécessaire, ajuster le titulaire canule afin de s'assurer qu'aucun coude de la vessel.Check des fuites sur le réglage manuel. Répétez les étapes 5.6 à 5.7 augmente le cadran à 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) et ainsi de suite jusqu'à la pression désirée est atteinte. Env. le temps = 15 – 30 min 6. L'incubation de la cuve sous pression Connectez l'ensemble régulateur de température à 37 ° C. Avec une deuxième pompe péristaltique perfuser tampon Krebs (1 mL / min) dans le bain de la chambre du navire. Connectez aspiration à la chambre de s'assurer que la couche supérieure du bain est enlevé. Incuber récipient sous pression à 37 ° C pendant 1 heure à la pression réglée sur automatique. Vérifiez la pression ne fuit pas (passer à manuel) périodiquement. Les effets de diverses interventions pharmacologiques peuvent être observés en ajoutant simplement le composé dans le bain pendant l'incubation. Env. temps = 1 heure 7. Perfusant le récipient sous pression avec du sang total Durant l'incubation d'obtenir au moins 7,5 mL de sang total humain / navire recueillies dans 40 héparine U / ml de sang. Incuber dans un falcon de 50 ml à 37 ° C. 10 minutes avant la fin de tIl sanguins étiquette incubation avec VybrantDil (1:1000) pendant 10 minutes à 37 ° C dans l'obscurité. Après 10 minutes, prélever du sang dans une seringue de compensation des bulles et de fixer sur un pousse-seringue avec une veste thermique fixée à 37 ° C. Fermez capteur P1 à la chambre / navire et les raccorder la seringue et la tubulure de déchets. Purge du sang à 1000 ul / min à travers la tubulure de déchets à éliminer les bulles. Ouvrez P1 à la chambre. Le servo de pression pour régler automatiquement pour maintenir la pression désirée. Perfuser le sang à 100 ul / min. En utilisant un microscope à fluorescence couplé à un appareil photo numérique d'enregistrer deux champs de la cuve perfusé pendant 15 secondes à 1, 3, 5, 7,5 et 10 minutes. L'intégrité de perfusion et de la fonction endothéliale message peut être évaluée par des techniques pharmacologiques comme myographe et d'expression des molécules d'adhésion peut être déterminé par immunohistochimie pour valider davantage la réponse inflammatoire. Env. temps = 15 minutes 8. Les résultats représentatifs: Un diagramme schématique de la configuration de la chambre de pression est montré dans la figure 1. Avec un appareil photo numérique couplé à un microscope à fluorescence des résultats peuvent être visualisés instantanément via des enregistrements vidéo en direct. Images vidéo représentant sont vus dans la figure 3 où les leucocytes sont considérés comme des adhérents à l'endothélium, si elles sont restées stationnaires pendant 10 secondes. Avec les enregistrements vidéo sur les cellules boucle continue respectées peut être compté comme un champ moyen par. Bien que les deux bas (figure 3A) et élevé (figure 3B) la pression va causer une certaine quantité d'adhérence une augmentation significative de l'adhérence des leucocytes à la pression plus élevée intraluminale est vu et cela est également démontré quantitativement (figure 4). Figure 1. Pressurisée ex vivo navire schématiques chambre. Un navire canulées connecté à un proximale (P1) et un capteur distal (P2) qui permet aux capteurs de pression sanguine pour être manipulés dans le vaisseau. La perfusion est à travers le transducteur P1 et la pression est maintenue par l'intermédiaire du transducteur P2. Figure 2. Cannuala avec des liens. Liens polyester noir sont attachés à chaque canule. Figure 3. Images vidéo représentant. Adhérence des cellules dynamiques (flèche rouge) sous la fluorescence à 80 mmHg (A) et 120 mmHg (B) après 10 minutes de la perfusion. Figure 4. Adhérence des leucocytes dans les Sprague-Dawley carotide artères après 1 heure d'incubation à basse (80 mmHg) et haute pression (120 mmHg). *** P <0,001, analysé par deux voies à mesures répétées ANOVA en utilisant le test post hoc de Bonferroni.