Zerkarien Transformation und In-vitro- Anbau von Schistosoma mansoni Schistosomules

Schutzmaßnahmen: Schistosome Cercarien können direkt in die Haut eindringen, ohne die Bedürfnisse eines Schnittes oder Poren, und verursachen die chronische Krankheit Bilharziose. S. mansoni ist eine Sicherheitsstufe 2 Organismus, also richtige persönliche Schutzausrüstung und geeignete Schutzmaßnahmen zu beachten bei der Arbeit mit infektiösen Zerkarien werden. Die meisten der Geräte notwendig, um zu wachsen und verwandeln schistosomes ist Standard, mit ein paar wichtigen Ausnahmen in der Tabelle am Ende des Protokolls zur Kenntnis genommen. Alle Zerkarien Arbeit sollte in einem isolierten Raum durchgeführt werden. Schistosomules sollten in einem sterilen, genehmigt Biosicherheit Haube kultiviert werden. Zwei Schichten von Nitril-oder Latexhandschuhe getragen werden, da sollte ein Kittel, eine wasserdichte Schuhe, Hosen ohne Löcher oder Risse, und wasserdicht Ärmelschoner für Ihre Handgelenke und Arme. Im Falle eines unbeabsichtigten Ausbringens sofort Spray kontaminierten Bereich mit 70% Ethanol oder 10% Bleichmittel, reibt energisch, wenn auf Ihre Person. Dies wird ausreichen, um die Parasiten zu deaktivieren, sondern alle möglichen Infektionen sollten gemeldet und ernst genommen werden. Obwohl schistosomules nicht angeboren infektiöse, variieren institutionelle Vorgaben, und sollte konsultiert werden, um festzustellen, ob BSL2 Vorsichtsmaßnahmen bei infektiösen Lebensphasen erforderlich sind. Desinfizieren Sie alle Flächen, die in Kontakt mit potentiell infektiösen Substanz nach dem Experiment durchgeführt und entsorgen Abfälle in einem genehmigten geltenden Bestimmungen. HINWEIS: Cover Schnecke Host bins 1 bis 2 Tage vor dem Vergießen und vor Licht schützen 1. Harvesting Cercarien aus der Schnecke Host Füllen Sie ein sauberes, 500ml Becher frei von Waschmittel halbwegs voll mit destilliertem Wasser auf Raumtemperatur gebracht. Bei der Arbeit mit Host-Schnecken mit Miracidien zu verschiedenen Zeitpunkten infiziert, verwenden Sie einen separaten Becher für jede Infektion date (Dies ist besonders wichtig, wenn die Schnecken für zukünftige Experimente wieder verwendet werden). Die Größe der Becher kann auch kleiner sein je nach Erfahrung des Anwenders. Sammeln infizierten Schnecke Hosts, die Sie wollen, Schuppen und sorgfältig hinterlegen sie in das Becherglas mit einem Standard-Aquarienfische net und für allgemeine Zwecke Pinzette nach Bedarf. Legen Sie Becherglas auf einen Notfall Auffangwanne ca. 8 bis 12 cm unterhalb Lichtquelle eine Glühlampe. Lassen Sie Standplatz für 1-2 Stunden unter dem Licht. Cercarien verlassen die Schnecke Host, wenn sie hellem Licht ausgesetzt. Sorgfältig herauszufiltern Schnecken aus der Cercarien Mischung. Nehmen Sie zusätzliche Sicherheitsvorkehrungen, als Gemisch ist hochgradig ansteckend. Denken Sie daran, Cercarien können direkt durchdringen die menschliche Haut! Ersetzen Mischung unter Lichtquelle für ca. 15 Minuten, so dass keine Partikel Abfallstoffe zu begleichen. Transfer Cercarien in einen sauberen Erlenmeyerkolben mit einer Pipette, die Vermeidung der Ablagerungen am Boden des Bechers. Der Kolben wird bei ca. 45 °-Winkel auf Eis im Dunkeln für 45 bis 60 Minuten, so dass Cercarien in einer Ecke zu begleichen. Verwenden Sie eine 50-ml-Pipette von 75 bis 90% der Überstand zu entfernen und lagern es in Becherglas mit 10% Bleichmittel oder 70% Ethanol, dabei nicht zu lassen Wassertropfen mit Cercarien Tropfen aus der Pipette. Swirl den Erlenmeyerkolben mit Cercarien sanft auf die Cercarien in Lösung zu resuspendieren. Verwenden einer Pipette auf die Probe zu sterilen 50 ml konische Röhrchen übertragen. Die Röhrchen wieder auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Cercarien wird zum Boden des Röhrchens im Dunkeln zu begleichen. 2. Manuelle Umwandlung von Cercarien zu schistosomules Bevor Sie beginnen: Stellen Sie RPMI 1640 komplett (RPMI, 5% fötalem Rinderserum, 1X Pen / Strep) und warm bis 37 ° C. (Es ist wichtig, dass die Rinderfötenserum verwendet durch Inkubation inaktiviert wurde ein 56 ° C für 1 Stunde als schistosomes können empfindlich zu ergänzen). In einem biohazard Kapuze, entfernen Überstand bis auf 5 bis 10 ml Lösung in je 50 ml konische mit einer Pipette oder Vakuum-Gerät. Bringen Sie einen 22-Gauge-double-ended, Luer-lok Emulgieren Nadel zu einem entsprechend dimensionierten Spritze. Langsam ziehen Mischung in die Spritze. Sammeln Cercarien aus allen 50 ml-Tuben in einer Spritze. Seien Sie aufmerksam der tropfen. Drehen Sie vorsichtig Spritze über eine solche mit dem freien Nadel am Ende ist. Bringen Sie eine weitere Spritze aus auf diese Seite des emulgierenden Nadel. Pass die Mischung durch die Nadel insgesamt 40-mal (20 mal hin und her), um die Cercarien verwandeln. Positionieren Sie die Kartusche so dass die Mischung in der unteren Spritze enthalten ist und die obere Spritze leer ist. Entfernen Sie die obere Spritze und desinfizieren in 70% Ethanol. Kaution Mischung tropfenweise in ein sauberes hoch ummauerten 100mm x 50mm Pyrex Schüssel oder Kristallisierschale. Desinfizieren Sie Nadel und Spritze in 70% Ethanol. Fügen Sie 37 ° C RPMI 1640 komplette Medien, so dass dieBoden der Petrischale ist komplett abgedeckt, als ob Gießen einer Luria Broth Platte. Vorsichtig, um schistosomules in der Mitte der Petrischale zu sammeln. Vermeiden Sie Spritzer. Hinweis: Es kann sinnvoll sein, schalten Sie die Haube Licht für diesen Schritt, um weitere angemessene Visualisierung des schistosomules in der Mitte. Unmittelbar Kaution konzentriert schistosomules in ein frisches 12-well Zellkulturplatte auch mit einer sterilen Pipette. Wiederholen 2.9 und 2.10 bis schistosomules nicht mehr vorhanden sind in der Mitte der Schale (etwa 10 mal). Kaution jeweils anschließende Sammlung in ein frisches gut. Füllen Sie jede Vertiefung bis zur Hälfte (~ 1,5 ml) mit vorgewärmtem RPMI komplette Medien. Visualisieren Sie auf einem inversen Mikroskop auf Anwesenheit von schistosomules und Abwesenheit von Cercarien zu überprüfen. Wachsen die schistosomules in einer CO 2-Inkubator eingestellt auf 37 ° C und 5% CO 2. 3. Repräsentative Ergebnisse: Bis Transfer von transformierten schistosomules in Kulturmedien, Visualisierung unter einem inversen Hellfeld-Mikroskop (siehe Geräte-Tisch für ein Beispiel) sollte Ausbeute ein Bild ähnlich 1, in denen nur umgewandelt schistosomules sind in der Abbildung gut. Mögliche Verunreinigungen könnten intakt Cercarien, durchtrennt Zerkarien Schwänze, oder andere Fremdkörper. Wenn keine inverse Mikroskop zur Verfügung steht, wird eine Standard-Mikroskop oder sogar eine Dissektion Umfang ausreichen, um die schistosomules visualisieren. Beachten Sie, dass dieses Verfahren nicht immer zu verwandeln 100% der Cercarien. Abbildung 1: Transformierte schistosomulum Abbildung 2: Cercarien und Severed Tails