Met behulp van een vergelijkende Soorten aanpak van de neurobiologie van Paternal antwoorden Onderzoek

1. Identificatie van de Animal Model De California Deer Mouse (Peromyscus californicus) is een ideaal model om vaderlijke reacties te verkennen. Zoals u ziet, deze muis grooms de pups net als de moeders doen – zelfs Crouch over hen, zodat het lijkt alsof de pups zijn verpleging. Het gedrag van de California muizen wordt vergeleken met een soort van hetzelfde geslacht, de gemeenschappelijke herten muis (Peromyscus maniculatus), die weinig interesse in de pups vertoont, vaak proberen te ontsnappen of zelfs aan te vallen. (Zie figuur 1 voor foto's van deze soorten interactie met pups.) Zodra de soort model is vastgesteld dan de verschillende groepen moeten worden vastgesteld. In deze studie, zijn biologische vader, maagden met geen ouderschap ervaring, en maagden met een beperkte blootstelling aan pup (pup-belichte of te bevorderen vaders) van beide soorten gebruikt, zodat zowel de aanleg en verworven vaderlijke kenmerken kunnen worden beoordeeld. In dit specifieke studie hebben we ook blootgesteld alle groepen een speelgoed muis pup om te verzekeren dat de sociale interacties die specifiek zijn voor een pup en niet een vertegenwoordiger reactie op alles geplaatst in de kooi (zie figuur 2). Voor onderzoek naar neurobiologische factoren, is het belangrijk om te bevestigen dat de geselecteerde soorten duidelijke verschillen in het gedrag van belang vertonen. In deze studie, zijn mannen in een kooi met een pup voor vijf minuten en een vaderlijke gedrag ethogram (zie tabel 1 voor voorbeeld van een ethogram) wordt gebruikt om te scoren gedrag, zoals vertraging van de pup en de hoeveelheid tijd doorgebracht in contact met de aanpak van de pup. Als agressieve reacties worden waargenomen, is de pup onmiddellijk verwijderd. Deze sessies zijn vaak gefilmd, zodat een zorgvuldige gedragsanalyse kunnen vervolgens worden uitgevoerd. 2. Voorbereiden van hersenweefsel Na een standaard perfusie van elke muis (protocol bijgevoegd), worden de hersenen verwijderd zodat ze kunnen worden coupes in het specifieke gebied van belang (show hersenen). Een standaard muis hersenen atlas (show atlas) wordt gebruikt om de paraventriculaire nucleus in de hypothalamus, een gebied dat bekend staat om rijk te worden in de cellen produceren van de neuropeptide van belang in dit onderzoek vinden – vasopressine (AVP). De hersenen wordt dan geblokkeerd en gemonteerd op een bevriezing boorkop, zodat het weefsel zal bevriezen voordat ze coupes met de microtoom. Het brein is verdeeld in een TRIM MODE tot er concrete monumenten worden geïdentificeerd, dan is de specifieke hersengebieden dikte van 30 micron in dit geval, is ingesteld voor de hersenen secties gebruikt voor analyse. De hersenen secties worden zorgvuldig geplaatst in goed platen gevuld met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS), (protocol voor PBS verbonden; Let op: dit is slechts een voorbeeld van een standaard protocol immunocytochemie). 3. Immunocytochemie Gedurende de verschillende stappen van dit proces (zie bijgevoegde protocol), is het belangrijk om nauwkeurig pipetteren vaardigheden om nauwkeurige metingen te garanderen van chemicaliën en andere ingrediënten belangrijk voor deze techniek (show student pipetteren). De eerste stap in dit proces is het wassen van de hersenen, die behelst de vervanging van de PBS in de goed platen drie tot vijf keer, tussen elke wasbeurt de well platen worden geplaatst op een rocker gedurende 10 minuten (laat student vervangt PBS en het plaatsen van putjes op rockers) . De hersenen plakjes worden dan blootgesteld aan het primaire antilichaam oplossing en bewaard bij 4 ° C gedurende de nacht op de rocker (show-proces). Naar aanleiding van een ander wassen, zijn de hersenen plakjes blootgesteld aan een tweede antilichaam voor een uur op de wip bij kamertemperatuur, dan weer gewassen. Vervolgens worden de hersenen worden blootgesteld aan een Avitin-biotine Complex oplossing voor te bereiden voor de visualisatie van de neurochemische-positieve cellen. Voor de laatste visualisatie stap worden de hersenen blootgesteld aan DAB. Dit is een gevaarlijk product en moet altijd worden behandeld met de nodige voorzichtigheid. Zoals hier te zien, de hersenen plakjes beginnen te donkerder te krijgen voor je ogen (show-proces). Naar aanleiding van de DAB-belichting, de hersenen gaan door de laatste serie van wast en zijn vervolgens zorgvuldig geplaatst op subbed objectglaasjes en laten drogen 's nachts (laat de plaatsing van een brein slice op een dia, zie bijlage voor subbed dia-protocol). De dia's worden dan gewist door een serie van gedestilleerd water en alcohol wast, eindelijk ondergedompeld in Citrosolv alvorens te worden afgedekt en opgeslagen in een slidebox voor het veilig houden van (tonen verschillende aspecten van dit proces; zie bijlage voor het opruimen van proces). 4. Neuroquantification Na de dia's zijn opgedroogd, kunnen ze worden beoordeeld met gespecialiseerde neuroquantification software. Hier Bioquant software wordt gebruikt om de vasopressine-positieve cellen en vezels te kwantificeren in de paraventriculaire kern van de muis hersenen (show-software op het scherm … en microscoop). Het specifieke gebied van belang is geïdentificeerd met behulp van de meting optiesvan de software om het visuele veld vast te stellen voor neuroquantification. Het is belangrijk dat een consistente visuele veld grootte is gekwantificeerd voor elk dier (toon student om dit te doen). Hier is het donker gekleurde vasopressine-immunoreactieve cellichamen en vezels zijn duidelijk zichtbaar. Omdat het moeilijk is te tellen of sporen van dit weefsel, een speciale eigenschap van deze software gebruik maakt van licht drempeling om de totale hoeveelheid van positief gekleurde weefsel te bepalen binnen het opgegeven interessegebied. Deze drempelwaarden vertelt ons hoeveel van het opgegeven gebied bevatte vasopressine-positieve weefsel (laat de gegevens waarde op het computerscherm). 5. Behavioral Analysis Als er meer dan een waarnemer zal het scoren van de videobanden, is het belangrijk om interbeoordelaarsbetrouwbaarheid te stellen om te verzekeren dat de waarnemers zijn het gedrag op een consistente manier scoren. Voor de feitelijke score sessie, moeten een gedrag scoreblad bereid zijn om voor het eenvoudig scoren van gedragingen te kunnen observeren tijdens de sessies (zie tabel 2 voor voorbeeld van het scoren spread sheet). Voor gedragingen die niet snel episodisch reacties, kan een microsequencing analyse blijkt subtiliteiten over de progressie van de specifieke antwoorden. Bijvoorbeeld, poetsgedrag bestaat uit een keten van zeer snelle respons. Hoewel het een optie is om gewoon registreren de aanwezigheid en de duur van de verzorging, een ander is het documenteren van de keten van gebeurtenissen bij deze reactie. Met behulp van deze microsequencing software, waarnemers score de aanwezigheid van een bepaald gedrag elke seconde, zoals gevraagd door de software (show-software en video). Na het verzamelen van gegevens, zijn de parameters die van belang bepaald en de juiste gedrags-scores worden geanalyseerd. Voorbeelden zijn totale duur van de tijd doorgebracht in contact met de pup, of het aantal storingen in de verzorging volgorde (show computer met spread sheet met gegevens die zijn ingevoerd voor elk dier) zijn. Zodra het gedrag wordt gescoord is het belangrijk om te bevestigen dat de twee soorten verschillende responsstrategieën tentoongesteld voor het gedrag van interesse in de studie. In dit geval is het California hert muizen zou moeten vertonen meer vaderlijke gedrag dan de gewone herten muizen. Daarnaast kunnen verschillende gedragsmaatregelen worden gecorreleerd met de hersenen maatregelen om een ​​beter onderbouwd overzicht van de relevante invloeden te krijgen. 6. Representatieve resultaten: Om valideren van het model, moeten de gegevens geven duidelijk aan dat de twee soorten verschillend uitgevoerd met betrekking tot het gedrag van belang. Hier zie je dat de P. californicus mannen besteedde meer tijd verzorging en ineengedoken over de pups, twee kenmerken van vaderskant reacties (zie figuur 4). Om te bepalen of de neurobiologial variabele rente is belangrijk in vaderlijke reacties, de hoeveelheid vasopressine (AVP)-positieve weefsel werd gekwantificeerd voor de verschillende relevante hersengebieden, zoals te zien is, de vaderlijke P. californicus dieren had meer immuun-positieve weefsel in een aantal van deze hersengebieden. (Zie figuur 5). In een gerelateerde studie met behulp van de microsequencing analyse, werd de hypothese dat de vaderlijke Californië muizen zouden minder angst dan hun maagdelijke tegenhangers vertonen, daarom, bij blootstelling aan een roofdier geur, de vaders minder onderbrekingen tentoongesteld in de verzorging volgorde dan de maagd dieren (zie figuur 6). Figuur 1: (A) Man California muizen vertonen vaderlijke de reacties in de richting van soortgenoten alien pup. (B) Man herten muis vertoont een voorzichtige aanpak (stretch bij te wonen) en het vermijden respons in de aanwezigheid van een vreemde soortgenoten pup. Opmerking: In deze sociale interactie evaluaties, als een mannelijke agressieve reacties vertoont in de richting van de pup, de onderzoekers meteen raakte de bovenkant van de kooi aan de mannelijke af te leiden. Op dit moment is de sessie wordt beëindigd en de pup wordt verwijderd, gecontroleerd op eventuele verwondingen en keerde terug naar de moeder. In ons laboratorium, dit zelden wordt waargenomen met P. californicus mannen, maar wordt af en toe waargenomen met P. maniculatus, nauwkeurige observatie en onmiddellijke interventie echter te voorkomen dat schade zich voordoet voor de dieren. Figuur 2: Een California muis interactie met een speelgoed muis, de meeste probeerde te kauwen op deze stimuli. Figuur 3: Experimentele ontwerp van de studie, waren er ongeveer 6 dieren in elke groep voor elke soort. Figuur 4: Grafische van immunocytochemie proces. Vijgure vijf vaders reacties in de Californische en herten muizen;. meer vaderlijke reacties (bruidegom, hurken, snellere aanpak) werden waargenomen in de Californische muizen. Meer stretch woont (stress respons) werden waargenomen in de herten muizen. Figuur 6. Vasopressine immunoreactiviteit in verschillende hersengebieden van beide soorten. De California muizen hadden meer kleuring in de PVN cellen en vezels. Figuur 7: Paternal Californië muizen minder storingen vertoonden in hun verzorgen sequenties in de aanwezigheid van een roofdier geur dan de pup-blootgestelde en maagd groepen.