1. De voorbereiding van B. subtilis culturen Inoculeren cellen van -80 ° C voorraden in 10 ml time-lapse microscopie (TLM) medium (62 mM K 2 HPO 4, 44mm KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 6,5 mM natriumcitraat, 0,8 mM MgSO 4, 0,02% casamino zuren, 27,8 mM glucose, 0,1 mM L-tryptofaan, werd de pH ingesteld op 7 met behulp van een KOH-oplossing), aangevuld met antibiotica, indien nodig. Groeien de cellen 's nachts in een schudfles (30 ° C, 225 rpm). De volgende ochtend, verdunnen de cellen 1:10 in voorverwarmde chemisch gedefinieerd medium (CDM) (62 mM K 2 HPO 4, 44mm KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 6,5 mM natriumcitraat, 0,8 mM MgSO 4, 2,2 mm glucose, 2,1 mM L-glutaminezuur, 6 uM L-tryptofaan, 7,5 uM MnCl 2, 0.15 x metalen mix (voor te bereiden 50x MT mix voorraad (ref 8), die bevat: 0,2 M MgCl 2, 70 mM CaCl 2, 5 mM MnCI 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,2 mM thiamine-hydrochloride, 2 mM HCl, 0,5 mM FeCl 3 (add laatste)) zonder antibiotica. Groeien de B. subtilis cellen tot midden-exponentiële fase (30 ° C, 225 rpm). Meestal is dit duurt ongeveer vier uur. Belangrijk is dat de voorbereiding van de agarose schuift een uur voor de cellen te bereiken mid-exponentiële fase (zie hoofdstuk 2). Meet de extinctie van de cultuur bij 600 nm (A 600) en verdun de cellen aan een ongeveer A 600 van 0,035 gebruik van CDM. Dit OD zorgt ervoor dat individuele cellen met de juiste afstand zijn gespot op de microscoop glijbaan voor time-lapse microscopie. 2. De voorbereiding van de microscoop monster (zie ook figuur 2) Een uur voor cellen te bereiken mid-exponentiële groei, de voorbereiding van de microscoop dia als volgt: Schoon twee microscoop glazen objectglaasjes (bijv. Knittel Glass, 7,6 x 2,6 cm,) met 70% ethanol en water. Neem een gen frame (ABgene; 1,7 x 2,8 cm) en voorzichtig een van de plastic folie van het gen dat frame te verwijderen zonder dat demontage van het plastic deksel op de andere zijde van het gen frame. Bevestig het gen frame in het midden van een van de glazen dia's door eerst de contacten vergemakkelijkt op slechts een zijde, gevolgd door begeleide bevestiging van de overblijvende gen frame met een vingernagel. Voorkom luchtbellen, terwijl het bevestigen van de gen frame om het glas schuiven. Gebruik een magnetron tot 150 mg (1,5%) met een hoge resolutie bij lage temperatuur smeltende agarose (Sigma) in 10 ml CDM te ontbinden. De agarose moet volledig worden opgelost te krijgen minimale achtergrondinformatie die nodig is voor de time-lapse microscopie experimenten. Indien nodig, aan te vullen van de agarose-CDM met inductor of andere verbindingen op dit moment Overdracht 500 ul van de warme agarose-CDM in het midden van het gen frame. Zorg ervoor dat het hele gebied met inbegrip van (de grenzen) is volledig gedekt. De volgende stappen (2.6 tot 2,10) moeten snel uitgevoerd worden om uitdroging van de agar-CDM te voorkomen. Leg de tweede glaasje op de agarose-CDM gevulde gen frame. Probeer om luchtbellen te voorkomen. Plaats de ingeklemd dia's in een horizontale positie gedurende 45 min bij 4 ° C in de koelkast, zodat de agarose-CDM voldoende stollen. Schuif af de bovenste glaasje. Gebruik een scheermesje uit te snijden agar strips van ~ 5 mm breed binnen het gen frame, waarop de cellen worden gekweekt. Een maximum van drie stroken kunnen gebruikt worden per slide, gescheiden door ~ 4 mm ruimte aan beide zijden. Deze ruimtes zullen de lucht die essentieel is voor B. subtilis groei. Als vier verschillende stammen moeten worden gevolgd in de tijd, kunnen twee strips worden gemaakt en worden gesneden in de helft resulteert in vier kleine vierkantjes. Verwijder eventuele resterende vast medium. Verwijder voorzichtig het tweede en laatste plastic deksel van het gen frame aan de kleverige kant van het gen kader bloot Load enkele cellen (van stap 1.5) op de solide medium zonder te raken met de pipet tip. Gebruik 2,5 ul voor een hele strip, of een ui voor een kleine plein. Begin altijd op de top van de agarose pad en laat de vloeistof op gelijke verspreiden op zijn aangewezen groeigebied door het schuiven op en neer. De dia klaar is, zodra de randen van de vloeistof wordt golfkarton en de beweging van de vloeistof niet meer zichtbaar is bij het draaien van de dia. Plaats een schoon objectglaasje dekglas (24 x 50 mm) op het gen frame van de ene kant naar de andere (vermijd luchtbellen). Garanderen een volledige bevestiging door druk uit te oefenen op het deksel glijden langs het gen frame met uw nagel. Als het dekglas wordt geplaatst op de cellen zonder dat ze lang genoeg drogen, cellen hebben de neiging om op de top van elkaar groeien tijdens het experiment. Wees ook voorzichtig niet al te lang te wachten alvorens het dekglas, omdat de agarose wordt dan te droog. Pre-warm de glijbaan voor 1 uur bij 30 ° C. Als de dia wOuld direct worden geplaatst in de voorverwarmde klimaatkamer (zie stap 3.1) van de microscoop, kan de temperatuur schommelingen veroorzaken autofocus problemen in de eerste uren van het experiment. 3. Time-lapse fluorescentie microscopie (zie ook figuur 3 en Film 1) Pre-warm de milieu-kamer op tijd (in onze handen op zijn minst 2 uur voor de start van het experiment) om autofocus problemen te voorkomen na het starten van het experiment. De benodigde tijd hangt af van de milieu-kamer en gebruikt als de verwarming en de microscoop. Selecteer de juiste doelstelling, filters en dichroïde spiegel volgens uw experimentele set-up. Voor lange experimenten ervoor te zorgen dat een UV-filter is geplaatst tussen de lichtbron en het monster. Ook, indien mogelijk, blokkeren een deel van de excitatie licht met behulp van grijsfilters om blootstelling te minimaliseren. De volgende apparatuur (geleverd door DeltaVision, Groot-Brittannië) werd gebruikt voor de time-lapse microscopie experimenten gepubliceerd in de Jong et al. 2010 5:. IX71 Microscope (Olympus), CoolSNAP HQ2 camera (Princeton Instruments), 300W Xenon Light Source, 60x helder veld doelstelling (1,25 NA), GFP filterset (Chroma, excitatie bij 470 / 40 nm, emissie 525/50 nm), mCherry filterset (Chroma, excitatie bij 572 / 35 nm, emissie 632/60 nm). Autofocus werd uitgevoerd met behulp van diascopic licht en het gebruik van de autofocus routine aanwezig in Deltavision's Softworx software. Opgemerkt moet worden dat er nu een aantal andere autofocus systemen die ook geschikt zijn, zoals de Zeiss Definite Focus, de Nikon Perfect Focus System en het Leica Adaptive Focus Control. Programma uw experiment op basis van uw experimentele set-up. Het is verstandig om de hoeveelheid licht die nodig is voor specifieke constructies, evenals het autofocus-instellingen te bepalen voor andere time-lapse microscopen of bacteriën voorafgaand aan het eigenlijke experiment. Kortere sluitertijden en minder hoeveelheid excitatie licht zal minimaliseren bleken en fototoxiciteit. Gebruik diascopic licht voor de autofocus routine. De volgende instellingen werden gebruikt voor de time-lapse microscopie experimenten gepubliceerd in de Jong et al. 2010 5:. Snapshots voor films werden genomen met tussenpozen van 8 of 12 minuten met 10% APLLC witte LED-licht en 0,05 s belichting voor heldere foto's veld, 10% Xenon licht en 0,5 s blootstelling voor GFP detectie, en 32% Xenon licht en 0,8 s blootstelling voor mCherry detectie, respectievelijk. Onbewerkte gegevens werden opgeslagen met behulp van softWoRx 3.6.0 (Applied Presicion). De autofocus is geprogrammeerd voor 0,06 micrometer stappen en een totaal bereik van 1,2 urn. Plaats de voorbereide dia (deel 2) in de voorverwarmde milieu kamer van de microscoop en toezicht op de uitgroei van enkele cellen in een microcolony monolaag bij 30 ° C. Specifieke tips: Selecteer de losse cellen die zich bevinden in het midden van de agar pad. De randen van de agar pad drogen gemakkelijker. Bewaar de X, Y, Z positie met behulp van de microscoop van de software. Grote bewegingen van het podium in de X, Y en Z-richting zou kunnen verstoren de agarose en daarmee belemmeren de identificatie van cellen door de autofocus routine. In het algemeen, te minimaliseren X, Y, Z beweging, hebben we niet selecteren meer dan 10 posities per experiment ook als een dia bevat meerdere stammen. Nadat de geselecteerde eerste cel, maar stel de Z-focus met de software. Vanaf dit punt, niet handmatig veranderen van de focus op de microscoop lichaam met behulp van de "Z-knop", tenzij dit wordt digitaal gecodeerd. Zorg ervoor dat na elke autofocus routine van de nieuwe X, Y, Z-positie wordt opgeslagen door de software. Controleer of de autofocus instellingen geschikt zijn voor het experiment, vóór het begin van de run. Het gebruik van fase-contrast microscopie kunnen verbeteren van de autofocus routine vergelijking met het gebruik helderveld of DIC microscopie, als gevolg van een verbeterd contrast. Echter, de fase-ring-in fase-contrast doelstellingen maakt ze minder gevoelig (ongeveer 10%) in het verzamelen van fluorescentie licht. Dus voor zwakke tl-samples, is een objectief zonder fase-ring beter geschikt. Controleer of de geselecteerde cellen nog steeds scherp in beeld om het half uur, totdat het experiment is stabiel draait. Wanneer de cellen op dit punt zijn onscherp, handmatig aanpassen. Als gevolg van temperatuurschommelingen, evenals slecht gedroogde monsters, kan dit noodzakelijk gedurende de eerste uren. Bovendien, als gevolg van verbeterde contrast, de autofocus werkt beter als er meer cellen zijn op het gebied van weergave. Na het experiment is voltooid, scheiden de verschillende kanalen van de film en veilige ze als aparte bestanden (dat wil zeggen fase-contrast, GFP, mCherry) indien nodig (bepaalde overname pakketten zullen alle kanalen in een gestapelde bestand). Voor publicatie, foto's kunnen worden versterkt door 2D deconvolutie, die vooral is onseful voor eiwit lokalisatie studies. Deconvolve de foto's met behulp van uw microscoop software of met een commercieel pakket zoals Huygens ( www.svi.nl ). Analyseer de gegevens met behulp van ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) (gebruik de ruwe, onbewerkte image bestanden voor deze) en Microsoft Excel of Sigma Plot. Stapels kunnen bijvoorbeeld worden opgeslagen als een. "Avi" film-bestand in ImageJ. Een gedetailleerde beschrijving van hoe de fluorescentie van individuele cellen kan worden gemeten in de tijd wordt hieronder gegeven. 4. Data-analyse van de promotor activiteit dynamiek met behulp van ImageJ Wij merken op dat andere goede software pakketten beschikbaar zijn, die zijn gespecialiseerd in het analyseren van time-lapse microscopie beelden, zoals BHV software 9, 4, Schnitzcell 10, PSICIC 11, en Microbe-Tracker 12, maar hier richten we ons op de vrij beschikbare ImageJ pakket. Download ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) en (indien nodig) de juiste plugin om uw (gestapelde) bestand te openen. Bijvoorbeeld, films opgenomen met een deltavision microscoop kan alleen worden geopend in ImageJ met de deltavision opener plugin. Kopieer de DV-plugin in de plugin ImageJ map en start het programma. Wijzig de geheugencapaciteit in edit / optie / geheugen en discussies tot 1250. Dit maakt het werken met grotere bestanden, zoals die verkregen uit time-lapse filmpjes. Voor de beoordeling van de cel geschiedenis van een enkele cel, opent u de originele fase contrast filmpje van een microcolony en ga naar de laatste frame van belang in de film. Selecteer de "gesegmenteerde lijnen" selectie knop in het menu. Teken een lijn op de achtergrond in en druk op "CTRL" + "T". Dit opent de regio's van belang (ROI) manager. (De overeenkomstige achtergrond fluorescentie waarde kan worden gebruikt om handmatig af te trekken op de achtergrond -.. Zie hieronder Als alternatief kan de achtergrond aftrek routine huidige gebruik in ImageJ) ook een lijn trekken in de cel van rente en voeg de ROI van de ROI manager. Aangezien wij onderzoeken promoter-GFP fusies in deze case study en het GFP wordt verspreid in heel het cytoplasma, moet de gehele cel hebben soortgelijke fluorescentie waarden voor elke afzonderlijke pixel over de lengte van de cel. Scroll een frame terug in de tijd in en selecteer een nieuwe ROI in dezelfde cel van belang. Bewaar deze derde ROI en verder met de procedure tot het overeenkomstige ROI in het eerste frame van de film is opgeslagen. Wees ervan bewust dat de fluorescentie van de dochter van cellen sterk kan variëren na de celdeling. Of gebruik maken van een membraan kleurstof die samen kunnen worden toegepast met fluorescentie eiwitten geproduceerd door de cellen (zoals de combinatie van de rode kleurstof membraan FM ® 5-95 (Invitrogen) en GFP) om septum vorming te visualiseren. In dit geval is de bijbehorende fluorescentie kanaal en niet de fase-contrast film moet worden gebruikt om cellen te volgen in de tijd. Als alternatief kan een verblijf op de veilige kant door het selecteren van ROI's in slechts een helft van een cel. Binnen de ROI manager, klik op "Opslaan". Als het einde van het bestand is ". Roi ', dan is een roi is geselecteerd in de lijst, en alleen deze ene zal gered worden. Als het einde van het bestand is ". Zip", dan wordt de hele set wordt opgeslagen (vereist). Sluit de fase-contrast film en open de originele fluorescentie film (bijv. GFP). Klik op "alle tonen 'en' meten 'in de ROI manager. Een nieuw venster wordt geopend (resultaten). Kopieer de resultaten in een Excel-sheet en aftrekken van de gemiddelde fluorescentie voor elke afzonderlijke cel van de achtergrond fluorescentie van het medium. De resulterende netto-fluorescentie kan worden uitgezet tegen de tijd om de promotor activiteit van de cel van belang in de tijd te onthullen. Als alternatief kan de fluorescentie van alle cellen van een microcolony worden geanalyseerd op een bepaalde tijd-punt. Om dit te doen selecteren en opslaan ROI's voor de achtergrond en elke cel in een frame zoals hierboven beschreven, kopieer de fluorescentie waarden naar Excel en produceren histogrammen met behulp van de "histogram" functie in de "tool" menu. Voor het verkrijgen van foto's van afzonderlijke frames voor publicatie, selecteert u het kader van belang, selecteer "afbeelding" – "kopie van de foto" en verander het type beeld op "RGB" of "8-bit" door "image" – "type" – "RGB kleur" of "8-bit". Sla de dubbele frame ". Tiff". De RGB/8-bit foto's kunnen worden geopend door middel van conventionele tekenprogramma's zoals CorelDraw of Adobe Illustrator. Indien nodig kan de foto worden aangepast met behulp van "image" – "aanpassen" – "helderheid / contrast" of "image" – "aanpassen" – "venster / niveau" in ImageJ. 5. Het produceren van films voor de publicatie met ImageJ Open de oorspronkelijke fase contrast en de bijbehorende fluorescentie film (s) in ImageJ zoals hierboven beschreven. Selecteer de rechthoekige selecties knop (1 st aan de linkerkant) en teken een rechthoek ROI in het eerste frame op een zodanige wijze, dat de zich ontwikkelende microcolony wordt omsloten door de ROI throughout de hele film. Selecteer "image" – "crops" en veilige deze kleinere versie van de film onder een nieuwe naam. Selecteer dezelfde ROI via de ROI manager in de fluorescentie film en ga verder zoals voorheen. Het combineren van de film horizontaal of verticaal, selecteer "plugin" – "stack combiner". Indien gewenst kan een tijd stamper worden toegevoegd via "plugin" – "de tijd Stamper". Sla de combinatie stack ooit als ". Dv" of ". Tiff 'en een keer als". Avi "of QuickTime-film. Alternatief protocol Aanpassingen voor Streptococcus pneumoniae (figuur 4 en Film 2): 6. Voorbereiding van de S. pneumoniae culturen Grow S. pneumoniae-cellen (ingekapselde stam D39 13, of ingekapseld stam R6 14 als staande culturen in C + Y medium 15 bij 37 ° C tot een OD bij 600 nm A van ongeveer 0,4 is bereikt. Centrifugeer de cellen gedurende 2 min bij 14000 rpm en resuspendeer de celpellet in een volume van verse C + Y medium dat 14,5% glycerol (v / v) die zou resulteren in een A 600 nm van exact 0,4. Aliquot de cellen en bewaar ze bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Voor time-lapse microscopie, neem een hoeveelheid van eerder gekweekte S. pneumoniae cellen. Inoculeren 4 ml vers C + Y medium 1:100 met cellen van de -80 ° C aliquot deel. Groeien de cellen tot medio exponentiële fase tot een OD van A 600 nm van 0,1 – 0,2. Meestal is dit duurt ongeveer 2 uur bij gebruik van cellen van -80 ° C aliquots. 7. De voorbereiding van de microscoop monster Bereid een microscoopglaasje zoals hierboven beschreven voor B. subtilis, maar zorg ervoor dat de agarose complex C + Y medium bevat. Omdat S. pneumoniae is een microaerophile, moet de luchtzakken tussen de agarose strips kleiner zijn dan voor B. subtilis (~ 1 mm ruimte aan beide zijden). Meet de extinctie van de cultuur bij 600 nm (A 600), vul de exponentieel groeiende S. pneumoniae cellen aan een ongeveer 600 A van 0,05 met behulp van C + Y medium en het gebruik van deze verdunning om de agarose slide te laden. 8. Time-lapse fase-contrast microscopie Pas de microscoop instellingen voor S. pneumoniae: gebruik fase-contrast microscopie, omdat S. pneumoniae is moeilijk vast te stellen met behulp van heldere-veld microscopie. Ga verder het protocol zoals beschreven voor B. subtilis (Volg de stappen 2,9 tot 3,7). S. pneumoniae cellen kunnen worden gekweekt op een van beide 30 ° C of 37 ° C (ze sneller groeien bij 37 ° C). 9. Representatieve resultaten: De time-lapse fluorescentie experiment is uitgevoerd met succes, als de bacterie groeide uit tot een microcolony monolaag, die volledig binnen het gezichtsveld ligt aan het einde van het experiment (zie figuur 5A-C). Als cellen groeiden op de top van elkaar, het is niet alleen onmogelijk te herleiden hun geschiedenis nauwkeurig, maar ook de fluorescentie levels van overlappende cellen kunnen niet goed worden gemeten. Cellen hebben de neiging om te groeien op de top van elkaar, als de gevlekte cellen waren niet voldoende gedroogd (stap 2.9) of als het medium samenstelling dient te worden aangepast aan een tragere groei te verkrijgen. Als een microcolony gegroeid uit het zicht, dan is de verdeling van de fluorescentie-signalen binnen een kolonie niet kan worden bepaald. Oorzaken voor "microcolony beweging" kan worden onvoldoende drogen van de gevlekte cellen (stap 2.9), of als de software is niet geprogrammeerd om de microcolony spoor tijdens de ontwikkeling. Verder is het belangrijk dat de lokale plekken van verhoogde fluorescentie niet detecteerbaar zijn in het medium, omdat dit verduistert de fluorescentie signalen afkomstig van de cellen (zie figuur 5D-F). Achtergrond gerelateerde problemen kunnen voortvloeien uit de media verbindingen, luchtbellen of onopgeloste agarose bosjes. Om dit te visualiseren, laten we in Fig. 5F achtergrond signalen van deze specifieke dia toen de foto werd gemaakt met excitatie / emissie-filters voor rood fluorescerende kleurstoffen. Zoals te zien is, heldere autofluorescente plekken aanwezig zijn die zouden kunnen hinderen beeldvorming. Om te voorkomen dat dergelijke plekken, zorg ervoor dat de agar volledig is opgelost en er zijn geen luchtbellen bij het plaatsen van het dekglaasje op het objectglaasje. Figuur 1: Experimentele overzicht Figuur 2: Voorbereiding van de microscoop monster Figuur 3: Time-lapse fluorescentie microscopie van B. subtilis cellen die drager zijn van een P kinB-GFP fusie. Snapshots zijn overgenomen uit een film. Top panelen: helder veld, onder panelen: GFP kanaal. Vijgure 4: Time-lapse fase-contrast microscopie van S. pneumoniae wild-type stam R6. Snapshots zijn afkomstig uit Movie 2. Figuur 5: Illustratie van mogelijk (time-lapse) microscopie resultaten. AC toont aan factoren die moeten worden overwogen voor de data verkregen met diascopic licht instellingen. (A) Helderveld microfoto van een microcolony monolaag (positief resultaat) van sporulerende B. subtilis cellen (B) Helderveld beeld van een B. subtilis microcolony waarin sommige cellen groeiden boven op elkaar (negatief resultaat) (C) Helderveld beeld van een sporulerende B. subtilis microcolony dat is gegroeid uit het gebied van focus (negatief resultaat). DF tonen factoren die moeten worden overwogen voor de data verkregen met episcopic licht instellingen (D) Fase contrast foto van B. subtilis cellen in de exponentiële fase afgeschilderd te visualiseren waar de fluorescentie signalen in E en F zijn afkomstig van (E) GFP-signalen van de cellen die in D. Merk op dat de achtergrond signalen zijn vergelijkbaar in elke pixel (positief resultaat). Merk ook op dat de blootstelling tijd zou kunnen worden te veel, omdat een cel toont een verzadigde signaal (negatief resultaat) (F) signalen verkregen door middel van het rode kanaal van de cellen die in D. Merk op dat de achtergrond gebieden met verhoogde rode fluorescentie niveaus (bevat negatief outcome). Film 1. Time-lapse fluorescentie microscopie van B. subtilis cellen die drager zijn van een P kinB-GFP fusie. Snapshots zijn genomen in 8 min. intervallen. Links: helderveld, Rechts: GFP-kanaal. Klik hier om de film te bekijken. Movie 2. Time-lapse fase-contrast microscopie van S. pneumoniae wild-type stam R6. Snapshots zijn genomen in 10 min. intervallen. Klik hier om de film te bekijken.
