一个用于标识Allelotyping PCR扩增沙门氏菌肠炎血清型，哈达尔，海德堡和鼠伤寒沙门氏菌

1。 PCR模板的制备 注：为了尽量减少PCR结转污染，重要的是要保持几个重要的PCR从一个物理分离的关键步骤：1）模板（DNA）的准备工作，2）PCR设置，和3）凝胶电泳。此外，还建议使用屏障提示，以防止pipetters文化或试剂污染。 从一个单一的孤立的殖民地隔离，接种1毫升卢里亚Bertani肉汤或其他复杂的介质（脑心浸液，Superbroth 等 ） ，沙门氏菌。培养过夜在37 ° C。 1毫升无菌1.5毫升容量离心管，离心细菌的细胞悬液，在4500〜2分钟XG。沉淀细胞。 弃上清，悬浮细胞沉淀在室温为10分钟，100％的乙醇和设置在1毫升。前（4500 XG，2分钟）。颗粒细胞，取出1毫升PBS上清，悬浮细胞。 离心机细胞（4500 XG，2分钟），弃上清和悬浮细胞，在1毫升无菌DH 2 O 最终的细胞悬液，1 / 20稀释DH 2 O（5μl/95μL生署2 O），并保存在-20 ° C 。在-20 ° C的全细胞PCR模板的保质期是一个月左右。 2。 PCR检测设置 注意：需要在PCR / UV工作站专用的最好做一个物理上独立的房间进行PCR反应混合物（模板，缓冲区，oligonucletoideprimers，核苷酸和Taq DNA聚合酶）的制备和配药。 注：PCR扩增成立房间还必须指定-20 ° C冰箱储存PCR试 ​​剂（缓冲区，寡核苷酸引物和核苷酸），酶和模板自成体系，专用pipetter PCR设置，一次性乳胶手套实验室大衣，阻隔提示，酶标板，玻璃毛细管，离心管，净化表面的漂白剂10％。使用专用的pipetter设置（P10，P100和P1000）免除PCR试剂。此吸管设置必须永远离开工作站设置。 注：获得分子生物学PCR级DH 2 O和分装1毫升到1.5毫升容量的离心管。免除每次使用后，以避免可能的交叉污染，分装 生署2。类似的方法，建议与其他PCR试剂。 注：与紫外光照射和/或10％漂白水擦拭表面使用前的净化工作区。在执行PCR检测设置，穿实验室外套和乳胶手套。最小化来回从PCR扩增交通设置PCR反应在thermocylcer和PCR产物（扩增）琼脂糖凝胶上分离培养的领域。如果你去到PCR设置区域，处置一双乳胶手套，你正在穿，穿上一双新的手套。 请在DH 2 O浓度5X10 -4米的主引股票稀释1 / 20，DH 2 O（5μl/95μL生署2 O 25微米）引物。表1描述了每个鞭毛打字引物的寡核苷酸序列。 从-20 ° C冰箱检索PCR试剂和模板，并允许试剂和样品在冰上解冻。 Taq DNA聚合酶，直到需要留在冷冻。 免除allelotyping PCR反应在表1中所​​描述的混合试剂。 免除到每个10圆底井PCR反应混合物9μl，在无菌，96孔，聚苯乙烯微孔板，在列的顶部（如A1），并开始向下移动列的顶下。 加入1μL生署2 9μLPCR混合物（无DNA控制）的第一口井（A1），阳性对照模板（0.5μLI /克，米打字引物，鼠伤寒沙门氏菌和肠炎; r/z10打字引物海德堡和哈达尔和1,2 / E，N，x分型引物，鼠伤寒沙门氏菌和哈达尔）微升至9日在第2次PCR拌匀（B1）的，1μL大肠杆菌K12DH5α中的在第三口井9毫升（C1）的PCR混合物。 对于每个额外的井（D1 – H1的A2，B2），加1μL解冻的样品模板9μLPCR反应混合物。对于I / G，M allelotyping PCR技术，S.沙门鼠伤寒沙门氏菌（I）和肠炎（G，M）作为阳性对照， 沙门氏菌血清型海德堡（R）和哈达尔（Z10）R / Z 10 allelotyping多重PCR阳性对照。 放入指定的爱达荷州技术Rapidcycler（8）持有10μL容量的玻璃毛细管。 一旦持有人担保，加载每个PCR反应混合物的玻璃毛细管触摸到毛细管微孔板底部井。持有人倾斜，使液体向下移动管，并提供空间之间的两端和前热封丁烷火炬玻璃管密封的毛细血管两端的PCR混合物。 放入爱达荷州技术Rapidcycler毛细管和持有和使用表1中描述的不同allelotyping引物运行的PCR热循环方案。 凝胶电泳步骤的热循环程序完成时继续执行。 3。凝胶电泳 注意：穿不同的白大褂电泳实验室使用指定的和一次性乳胶手套一双新。 注：戴防紫外线护目镜或面罩，总是处理溴化乙锭，特别是琼脂糖凝胶手套。 准备100毫升熔融1.5％（W / V）分子生物学级琼脂糖1xTAE（或1X TBE）电泳缓冲液多次在定期的视觉设置为2-5分钟的间隔在20％的功率有微波炉加热的琼脂糖悬浮（7）检查。熔化琼脂糖，直到它达到平衡的水浴温度设定在60℃水浴。 设置梳浇筑前熔化琼脂糖凝胶模具。选择一个有足够的牙胶梳产生足够的控制，样品，并至少有3分子量标准的目的和琼脂糖凝胶中的配售井。 添加溴化乙锭的2μL（10毫克/毫升）100毫升熔融1.5％（W / V）1xTAE琼脂糖（或简称TBE），轻轻漩涡瓶混合，避免产生气泡，轻轻倒入瓶中的内容到15 10厘米琼脂糖凝胶的凝胶模具中。用卫生纸或纸巾的边缘，在琼脂糖凝胶中删除任何气泡。 让凝胶在室温下模具，直到琼脂糖凝固（约30-45分钟）。转移与凝胶梳潜水，水平电泳室，含有1X TAE（或1X TBE）电泳缓冲液的凝胶托盘。轻轻取出梳子从琼脂糖凝胶。 检查的凝胶托盘相对的阴极或阳极电泳室，以确保这个极点在凝胶底部的位置。注意：请记住带负电荷的DNA向阴极迁移（即“红色”）。 预混料200μLDNA分子量标记6X DNA上样染料与40μL（0.25微克/微升）。 4.8μL预混的DNA分子量标记第十四负载第一，中间和最后一个井。 以及2起，并推进到每个后续以及由左到右，移动负载的PCR样本。避免加载任何含有分子量标准井的样品。 要加载在每个玻璃毛细管中的样品： 删除其持有和蚀刻毛细管与玻璃切割机的两端的每个毛细血管。 显着的毛细血管玻璃切割机两侧放置双手的拇指和食指上，单元的毛细血管。 PCR反应混合物放置在年底相反毛细管分配器和缓缓转动柱塞顺时针旋转，直到液体在管的底部。 放入要加载以及毛细血管和慢慢转动顺时针方向转动柱塞免除琼脂糖以及聚蔗糖加权样本。要小心，不要穿刺以及与毛细管或转动太多过去，当最后的液体使毛细血管以及引入气泡。 一旦被加载，所有的样品和标准设定的恒压电源为90 V（9伏/厘米琼脂糖凝胶）。 停止电泳的黄色染料（Taurazine）前一次是从凝胶底部1厘米。 一旦完成电泳，凝胶转移到紫外透射可视化的DNA片段，分子量标准。对宝丽来胶片拍摄的图像，使用橙色玻璃过滤器（设置：2个和4.5 Ÿ）宝丽来相机或热敏打印机使用的CCD相机和打印图像的数字图像。 放置在10％为15-30分钟漂白的毛细血管的持有人。与卫生署2 O和回原位PCR设置房间空气干燥冲洗3次。 4。代表多重PCR检测结果 allelotyping 沙门氏菌的PCR结果株1-10显示在图1（3-12车道），解释如下。 O等位基因指定沙门氏菌隔离的基础上扩增（PCR产物）匹配大小的PCR控制和预测为O等位基因引物集（3）：B – 560bp，C1 – 340bp，C2 – 400 BP， D1 – 620 bp，而E1 – 280 BP。对于与O allelotyping PCR（图1A），我们分配的O等位基因B（车道10菌株 -13），C1（7-9车道），C2（泳道4，5），D1（泳道3），E1（6车道）的十个沙门氏菌株车道3-12测试。这些相同的沙门氏菌株进行了测试，在相同的顺序如图。 1A，为H1等位基因I，G，M，R; Z10（图1B，C），。再次，H1等位基因是分配给每个隔离依赖于存在一个匹配的扩增片段大小的PCR控制和预测为4 H1等位基因引物集（3）：I – 510 BP（图1B，2巷）; G，M – 310 BP（图1B，2巷），R – 170 BP（图1C，2巷）;和Z10 – 360 BP（图1C，2巷）。 H1的等位基因被分配到10 个沙门氏菌分离：I -隔离3和8（图1B，5和10车道），G，M – 1菌株和5（图1B，泳道3和7）， R株6和9（图1C，泳道8及11条）;和Z10株2，7，和10（图1C，车道4，9，12） 沙门氏菌隔离4负四个H1的测试等位基因。最后， 沙门氏菌株进行了测试1,2 H2等位基因的PCR; 1,5; 1,6; 1,7抗原复合物，E，N，X，E，N，Z15抗原复合物。引物为H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7复杂和H2 E，N，X，E，N，Z15复杂，产生290 bp和150 bp的扩增产物，分别为（3）。引物不能区分具体的H2等位基因，不论是在H2抗原复杂的分配一个明确的等位基因类型，当然。 1,2，隔离（3） 沙门氏菌株4，6，8-10 1,2与H2 H2等位基因阳性; 1,5; 1,6; 1,7抗原复合物，而菌株2和7例阳性E，N，X H2等位基因;，E，N抗原复合物，Z15（数据未显示）。虽然沙门氏菌株1，3，和5负两个H2抗原复合物，只有隔离1和5负H2的鞭毛蛋白，作为确定使用一个通用的H2鞭毛PCR（1）（数据未显示）。这些结果总结在表2推定的沙门氏菌血清型，分配给每个隔离。 图1。多重PCR，确定具体的O和H等位基因与S 哈达尔，海德堡和鼠伤寒沙门氏菌肠炎血清型肠炎 （一）O等位基因多重PCR。 （B，C）H1等位基因识别鞭毛蛋白等位基因多重PCR：I / G，M（B）和r/z10（三）。泳道1和13：100 bp的阶梯（Promega公司;麦迪逊，威斯康星州）;巷2：O等位基因多重PCR控制I / G，M（B）和B，C1，C2，D1，E（A），H1的等位基因H1等位基因r/z10（C），和车道3-12： 沙门氏菌株1-10（见表2）。 PCR扩增预混试剂 热循环仪（Rapidcycler） 试剂 成分/浓度 金额   参数 预期大小 H1 I / G，M DH 2 O 63μL 计划1 94 ° C，1分钟 10X PCR缓冲液 20毫米氯化镁2 10μL 计划2 94 ° C，1秒 500 mMTris PH8 55℃1秒 2.5 mg / ml的BSA 72℃20秒 5％聚蔗糖400 40个循环 10 mMTartrazine 斜率= 2.0 底漆我（F）* AACGAAATCAACAACAACCTGC 2μL 计划3 72℃4分钟 510 BP 入门I（R）* TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2μL 底漆G，M（F）* GCAGCAGCACCGGATAAAG 2μL 310 BP 底漆G，M（R）* CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2μL 二甲基亚砜 5μL 的dNTP 10毫米 2μL Taq酶 5个单位/μL 2μL 90μL H1 R / Z 10 DH 2 O 55μL 计划1 94 ° C，1分钟 10X PCR缓冲液 30毫米氯化镁2 10μL 计划2 94 ° C，1秒 500 mMTris PH8 55℃1秒 2.5 mg / ml的BSA 72℃20秒 5％聚蔗糖400 40个循环 10 mMTartrazine 斜率= 2.0 引物R（F）* CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl 计划3 72℃4分钟 170 BP 引物R（R）* GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl 引物 Z 10（F） * GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 BP 底漆Z 10（R）* GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl 二甲基亚砜 5μL 的dNTP 10毫米 2μL Taq酶 5个单位/μL 2μL 90μL PCR扩增预混试剂 热循环仪（Rapidcycler） 试剂 成分/浓度 金额   参数 预期大小 H2的1,2 / E，N，X DH 2 O 63.6μL 计划1 94 ° C，1分钟 10X PCR缓冲液 20毫米氯化镁2 10μL 计划2 94 ° C，1秒 500 mMTris PH8 55℃1秒 2.5 mg / ml的BSA 72℃20秒 5％聚蔗糖400 40个循环 10 mMTartrazine 斜率= 2.0 引物1,2（F） * AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2μL 计划3 72℃4分钟 290 BP 引物1,2（R） * ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2μL 底漆发送，N，X（F）* TAACTGGCGATACATTGACTG 2μL 150 BP 底漆发送，N，X（R）1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2μL 二甲基亚砜 5μL 的dNTP 10毫米 2μL Taq酶 5个单位/μL 2μL 90μL 通用氢气 DH 2 O 72μL 计划1 94 ° C，1分钟 10X PCR缓冲液 30毫米氯化镁2 10μL 计划2 94℃10秒 500 mMTris PH8 45℃10秒 2.5 mg / ml的BSA 72℃35秒 5％聚蔗糖400 40个循环 10 mMTartrazine 斜率= 2.0 底漆fljB（F）* CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2μL 计划3 72℃4分钟 1500 BP 底漆fljB（R）* TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2μL 的dNTP 10毫米 2μL Taq酶 5个单位/μL 2μL 90μL 表1。 沙门氏菌的flagellinallelotyping PCR协议组成，条件和预期的结果。 * PCR引物工作的股权集中度为25微米 隔离 O等位基因 H1的等位基因 H2等位基因 血清型   乙 C1 C2 首长级薪级第1点 Ë 我 G，M ř Z10 1,2，1,5，1,6，1,7 E，N，X，E，N，Z15 通用1   1 – – – + – – + – – – – – 肠炎 2 – – + – – – – – + – + + 哈达尔/伊斯坦布尔3 3 – – + – – + – – – – – + 肯塔基州 4 – – – – + – – – – + – + 未知 5 – + – – – – + – – – – – 蒙得维的亚 6 – + – – – – – + – + – + 2 Infantis或魏尔啸 7 – + – – – – – – + – + + 姆班达卡 8 + – – – – + – – – + – + 鼠伤寒沙门氏菌 9 + – – – – – – + – + – </td> + 海德堡 10 + – – – – – – – + + – + 海法 表2。 Allelotyping PCR结果（图1）和沙门氏菌血清型指定的鉴定为O，H1和H2等位基因 > 1 H2 PCR扩增产生一个1.5 kb的扩增，所有拥有H2的鞭毛沙门氏菌，无论H2等位基因（1） 。这PCR是用来区分单相双相沙门氏菌 。 2 H2的多重PCR不能区分不同的等位基因的H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7抗原复合物（3）。 3 S 的噬菌体转换沙门哈达尔改变脂多糖O抗原产生血清型伊斯坦布尔。 Ø allelotyping PCR无法分辨这些细微的遗传/抗原的变化。 血清型1 O等位基因 H1的等位基因 H2等位基因   乙 C1 C2 首长级薪级第1点 Ë 我 G，M ř Z10 1,2，1,5，1,6，1,7 E，N，X，E，N，Z15 通用2 加利福尼亚州 + – – – – – + – – – – – 鼠伤寒沙门氏菌 + – – – – + – – – + – + 海德堡 + – – – – – – + – + – + 海法 + – – – – – – – + + – + 蒙得维的亚 – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – Athinai – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + 姆班达卡 – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + 肯塔基州 – – + – – + – – – – – + 哈达尔/伊斯坦布尔3 – – + – – – – – + – + + 肠炎 – – – + – – + – – – – – 芙蓉 – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + 洛美 – – – + – – – + – – – + 波特兰 – – – + – – – – + + – + 卢安达 – – – + – – – – + – + + Treguier – – – + – – – – + – – + 西米 – – – – + – – + – – + + Weltevreden – – – – + – – + – – – + 克里斯蒂安斯塔德 – – – – + – – – + – + + 比夫拉 – – – – + – – – + – – + 表3。Allelotyping PCR检测所确定的沙门氏菌血清型 1以粗体突出的血清型是较常用的诊断或食品微生物学实验室中遇到的。 2 H2的PCR产生一个所有拥有H2的鞭毛的沙门氏菌的1.5 kb的扩增，不管H2等位基因（1 ）。这PCR是用来区分单相双相沙门氏菌 。 3 S 的噬菌体转换沙门哈达尔改变脂多糖O抗原产生血清型伊斯坦布尔。 Ø allelotyping PCR无法分辨这些细微的遗传/抗原的变化。