Mapping hemmende neuronale Schaltungen durch Laser Scanning Photostimulation
Summary
Dieses Papier stellt einen Ansatz der Kombination von Laser-Scanning-Photostimulation mit Ganzkeim Aufnahmen in transgenen Mäusen, die GFP in begrenzten hemmende Neuronen Populationen. Die Technik ermöglicht die umfassende Abbildung und quantitative Analyse der lokalen synaptischen Schaltungen des spezifischen inhibitorischen kortikalen Neuronen.
Abstract
Inhibitorischen Neuronen sind entscheidend für die kortikale Funktion. Sie umfassen etwa 20% des gesamten kortikalen neuronalen Population und können weiter in verschiedene Subtypen auf ihre immunchemische, morphologischen und physiologischen Eigenschaften 1-4 basieren unterteilt werden. Obwohl frühere Untersuchungen haben viel über die inhärenten Eigenschaften der einzelnen Arten von hemmenden Neuronen zeigten, ist das Wissen über die lokalen Anschlüsse des noch relativ begrenzt 3,5,6. Da jedes einzelne Neuron die Funktion durch ihre erregenden und hemmenden synaptischen Eingang in kortikalen Schaltkreisen geprägt ist, haben wir mit Laser-Scanning-Photostimulation (LSP) auf Karte lokalen leitungsvermittelte Verbindungen bis spezifische inhibitorische Zelltypen. Im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation oder Glutamat puff Stimulation hat LSPS einzigartige Vorteile ermöglicht für umfangreiche Kartierungen und quantitative Analyse der lokalen Funktionseingänge einzeln erfasst Neuronen 3,7-9. Laser Photostimulation über Glutamat Uncaging aktiviert selektiv Neuronen perisomatically, ohne Aktivierung Axone der Passage oder distalen Dendriten, die eine sub-Laminar-Mapping-Auflösung sorgt. Die Sensitivität und Effizienz der LSPS für die Zuordnung von Eingaben aus vielen Stimulation Standorten über eine große Region sind bekannt für kortikalen Schaltkreis-Analyse geeignet.
Hier stellen wir die Technik der LSPS mit whole-cell Patch-Clamp für lokale inhibitorische Schaltung Mapping kombiniert. Gezielte Aufnahmen von spezifischen inhibitorischen Zelltypen sind durch die Verwendung von transgenen Mäusen, grün fluoreszierende Proteine (GFP) in geringgradige hemmende Neuronen Populationen in der Rinde 3,10, was im Einklang Abtastung der gezielten Zelltypen und eindeutige Identifizierung der Zelltypen erfasst ermöglicht erleichtert . Was LSPS Mapping, wir das System Instrumentierung skizzieren, beschreiben die Versuchsdurchführung und Datenerfassung und präsentieren Beispiele der Schaltung Mapping in Maus primären somatosensorischen Kortex. Wie in unseren Experimenten dargestellt, ist geschütztes Glutamat in einem räumlich begrenzten Bereich des Gehirns Scheibe durch UV-Laser-Photolyse aktiviert; gleichzeitige Voltage-Clamp-Aufnahmen ermöglichen die Erfassung von Photostimulation-evozierte synaptische Antworten. Karten entweder erregend oder hemmend synaptischen Input für die gezielte Neuron durch das Scannen des Laserstrahls auf Hunderte von möglichen präsynaptischen Seiten stimulieren generiert. So ermöglicht LSPS den Bau von detaillierten Karten der synaptischen Eingänge Auftreffen auf bestimmte Arten von hemmenden Neuronen durch wiederholte Experimente. Zusammengenommen bietet die Photostimulation-basierte Technik Neurowissenschaftler ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der funktionalen Organisation der lokalen kortikalen Schaltkreisen.
Protocol
Discussion
Photostimulation-basierte Mapping-Techniken sind effektiv für die Analyse von kortikalen Schaltkreisen eingesetzt. Laser Scanning Photostimulation mit Ganzkeim Aufnahme kombiniert die hohe Auflösung Abbildung von laminaren Verteilungen der präsynaptischen Input-Quellen zu einzelnen Neuronen, weil die gleichzeitige Aufnahme von einem postsynaptischen Neuron mit Photostimulation von Clustern von präsynaptischen Neuronen an vielen verschiedenen Orten bietet quantitative Maßnahmen der räumlichen Verteilung der exzitat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt DA023700 und DA023700-04S1 zu XX finanziert
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| transgenic mouse lines | Jackson lab or other sources | Please refer to Xu and Callaway (2009) | |
| GFP goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| vibratome | Leica Systems | VT1200S | |
| MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat No. 1490 | |
| biocytin | B4261 | ||
| electrode puller | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| glass tubes for making electrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| digital CCD camera | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Research microscope | Olympus, Tokyo, Japan | BW51X | |
| UV laser unit | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | model 3501 | |
| Other equipment for Laser scanning phostimulation | Please refer to Xu et al. (2010) |
Solutions:
- Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3).
- Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose)
- Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).
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