Nuestro plan experimental se esquematiza en el diagrama de la Figura 1. 1. El crecimiento y la preparación de células madre neurales humanas (NSC) para el trasplante El EnStem-Una línea celular (EMD Millipore) se utilizó en este estudio. NSCs son sistemáticamente validados por el fabricante para los altos niveles de expresión de los marcadores multipotentes nestina y Sox2, y bajo nivel de expresión del marcador pluripotente Oct-4, junto con la capacidad de diferenciarse en varios fenotipos neuronales y para mantener un cariotipo normal después de múltiples pasajes. En condiciones de nuestro crecimiento, estos NSCs muestra abundante expresión de Sox2 y nestina y mantuvieron su capacidad de diferenciarse, como se describió anteriormente 1. NSCs fueron cultivadas en poli-L-ornitina (20 mg / ml) y laminina (5 mg / ml) de cultivo de tejidos recubiertos frascos tratados. Las células fueron cultivadas en un medio de expansión neural (Millipore), complementado con L-glutamina (2 mM) y fibroblástico básicofactor de crecimiento (bFGF, 20 ng / ml). Monocapas adherentes de NSCs fueron pasadas cada dos días (1:2) con accutase como el agente de disociación 1. Para los estudios de trasplante, NSCs fueron utilizadas en los pasajes debajo de los 10. NSCs fueron etiquetados con 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) completando el medio de cultivo con M BrdU 4 durante tres días antes del trasplante. Para verificar el índice de BrdU (es decir, porcentaje de células BrdU positivas), las células se sembraron en la cámara de diapositivas y procesadas para la detección de BrdU utilizando métodos estándar de inmunohistoquímica. Las células utilizadas para el trasplante habitualmente presentan los índices de etiquetado de más de 90% 2. Por otra parte, trasplantado células madre humanas fueron detectados utilizando los recursos humanos marcador específico antígeno nuclear (HuNu) 2. En el día del trasplante, y los medios de comunicación neural accutase expansión se pre-calentado en un baño de agua a 37 ° C. Las células se colocan en medio de incubación (los medios de comunicación neuronal de expansión que contiene 10 mMde Y-27632) durante una hora. Y-27632 (inhibidor de rock, EMD-Calbiochem) fue utilizado para mejorar la supervivencia de NSCs post-trasplante. Después de una hora, medio de incubación fue removido y las células fueron tratadas con accutase durante 5 minutos. Después de este breve tratamiento añadir un volumen igual de los medios de comunicación de expansión neural para neutralizar el accutase y la tensión de las células a través de un filtro de 70 M de la célula. Contar las células con un hemocitómetro y preparar a 1,0 x 10 5 NSCs en vivo por microlitro en el medio de la inyección (los medios de comunicación neuronal de expansión que contiene 10 mM de Y-27632, de 40 ng / ml de bFGF, 20 ng / ml de BDNF). Las células se almacenan en los medios de expansión neural (como se describe en 1.5) y se mantuvieron en hielo hasta el momento del trasplante, y debe ser utilizado dentro de 6 horas para minimizar la muerte celular por prolongados de almacenamiento en frío. 2. Radioterapia – la planificación del tratamiento y la irradiación Sedado rata atímicos desnudos (s) fueron colocados en un escáner de resonancia magnética en el laboratorio positio propensos n con el cráneo en el extremo superior (de cabeza). Este escáner de 3 tesla está diseñado para las exploraciones de pequeños animales. Puede proporcionar exquisitos tejidos blandos contraste con alta resolución espacial de la sección transversal (axial) imágenes. La exploración se centró en la región del cráneo y un conjunto de 22 imágenes T2 E60 ponderado con 0,8 mm de espesor de la imagen se generaron. Estas imágenes proporcionan la información necesaria para identificar a la izquierda y la derecha dentro de hipocampo del cerebro de la rata. Después de la resonancia magnética (24 horas), los animales fueron sedados [cóctel anestesia (ketamina, 30 mg / kg, la xilazina, 2,5 mg / kg y acepromacina, 1 mg / kg)] y se coloca en un escáner CT de oncología de radiación en otra de corte transversal (axial) volumen de la imagen se ha generado. La rata fue colocada en el mismo o casi la misma posición que utiliza para la resonancia magnética y la unidad de CT se creó para explorar la región del cráneo. Un estudio de 106 imágenes de TC con 0,8 mm de espesor de la imagen se ha generado lo que se convirtió en el tratamiento de datos TAC de planificación. Planificación del tratamientoha "> Los datos de imagen MRI y CT fueron transferidas al software de tratamiento de ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA) a través de la planificación de DICOM (Digital-Imagen y Comunicación en Medicina). ECLIPSE es un software sofisticado y está disponible comercialmente en oncología de radiación para modelar y diseñar el plan de radiación mejor tratamiento para un paciente. Incorpora información de órganos de densidad que se extrae de los datos de imagen TC y se utiliza para calcular la distribución de la dosis de radiación dentro del cuerpo. Cubrir el animal con una sábana quirúrgica pequeña, con sólo la cabeza al descubierto. La posición de la cabeza del animal con firmeza dentro del marco estereotáxico (indicador de referencia digital, Leica-myNeurolab) mediante la inserción de barras de oído en el conducto auditivo externo. Tenga mucho cuidado al deslizar la punta de la barra de oído en el conducto auditivo. Coloque la barra de incisivos enganchando incisivos superiores de la rata y el ajuste de la altura de la barra hasta el punto de referencia estándar, y luego apriete la abrazadera nariz. Centro de la posiciónde la cabeza entre los barrotes del oído con un mínimo movimiento lateral (± 4 mm) para lograr cero estereotáxica. El siguiente paso en el proceso para determinar la técnica de irradiación para ser utilizado. De intensidad modulada radioterapia (IMRT) y volumétrica modulada de la terapia de arco (VMAT) en forma de RapidArc son dos técnicas de gran precisión que utilizan la irradiación de 6 MV de fotones de luz para brindar una dosis de radiación 3.6. La diferencia entre estas técnicas es que la IMRT administra una dosis con varias trayectorias estática cada uno correspondiente a una dirección diferente pero que convergen en el volumen de destino más adecuado para el volumen blanco muy pequeño. RapidArc por el contrario, libera una dosis de forma dinámica a través de uno o más arcos se centró en la región de destino (Fig. 4). Independientemente de la técnica de entrega, información sobre la dosis objetivo, de conformidad objetivo y las restricciones de dosis a órganos críticos tienen que ser ingresados en la ventana de optimización de la dosis en Eclipse. Tsu información junto con los volúmenes de órganos se utiliza para adaptar la distribución de dosis, que se consigue mediante la continua variación de la atenuación del haz durante la irradiación. Una vez que se ha generado un plan, Eclipse proporciona la dosis calculada superpuesto a las imágenes axiales, coronales y sagitales (Fig. 5), así como en el histograma dosis-volumen (DVH) en formato (Fig. 6). Es en este punto en el que el plan debe ser evaluado para determinar si es adecuado para la entrega o necesita ser mejorado. La irradiación de procesos Una vez que se aprobó un plan para la entrega, digitalmente reconstruida radiografía (RRD) las imágenes se generaron a partir de los datos de planificación de tratamiento en CT ECLIPSE. Estas son las imágenes ortogonales ponderada sobre la densidad ósea para resaltar el cráneo y otras prominencias óseas. A partir de entonces, el plan de tratamiento y de DRR son enviados al sistema de tratamiento informático de entrega a través de DICOM. El sistema de entrega de los controles de un acelerador lineal Varian Trilogy normalmente usadas para la radioterapia de los seres humanos. El acelerador está equipado con 120 controlado por ordenador colimadores multiláminas delgada (MLC) y una calidad de diagnóstico de rayos X de imagen incluidos en la imagen de a bordo (OBI) del sistema. Este sistema de entrega de carga la información ECLIPSE específicos y configura los parámetros del colimador en el acelerador para entregar la dosis planificada. En este punto, la rata fue preparado para la irradiación, sedado y cubierto con una manta de papel para mantener el calor. Después de unos minutos, la rata, con su manta, pero con el cráneo expuesto, se colocó en la mesa de tratamiento en la misma posición que utiliza para generar el TC. Este es un paso crítico porque exactitud de la posición está directamente relacionada con la precisión en la entrega de dosis. Una vez que la rata fue colocado correctamente en la mesa de tratamiento, un conjunto de ortogonales imágenes de rayos X se toma utilizando el sistema de la trilogía de la OBI. Estas son imágenes de alta resolución en la que se fusionaron posteriormente a la generación de ECLIPSEDRR d utilizando la imagen de OBI software de fusión. Las imágenes de rayos X y DRR fueron emparejados digitalmente utilizando el software que proporcionan información sobre cambios de posición de la tabla que se debe hacer para lograr el co-registro de las imágenes (Fig. 7). Después de revisar esta información y verificar que los cambios resultantes no darse cuenta de plomo en las colisiones entre el acelerador y la mesa de tratamiento, el equipo aplica los cambios y la mesa de tratamiento se mueve automáticamente a la posición deseada. En este punto, comienza la irradiación. Para administrar una dosis de 10 Gy con un plan de 6 de campo IMRT, el rayo-el tiempo es de aproximadamente 10 minutos, mientras que un arco de dos RapidArc lleva alrededor de 3 minutos. Después de la entrega que termine el tratamiento, la rata fue retirado de la sala de tratamiento y se les permite recuperar en una jaula de la celebración de mantenerse en una almohadilla térmica. 3. Cirugía estereotáxica para el comercio intra-hipocampal del trasplante de células madre humanas Animals cría y preparación quirúrgica Para este estudio, se emplearon dos ratas meses ATN adquirió de Instituto Nacional del Cáncer (cepa 0N01 Cr: NIH-RNU). Los animales fueron mantenidos en jaulas estériles y mantenida a una temperatura y luz controladas barreras Un entorno con luz 12-h/12-h / oscuridad ciclo. Las ratas se les proporcionó alimento autoclave y agua ad libitum y se tuvo cuidado para prevenir la infección del ojo por la limpieza de los ojos de todas las semanas con pomada Vetropolycin (Supply Western Medical, Arcadia, CA). Para la cirugía estereotáxica, las ratas fueron anestesiados con una inyección ip de cóctel anestesia (ketamina, 30 mg / kg, la xilazina, 2,5 mg / kg y acepromacina, 1 mg / kg). Anestesia completa fue inducido después de 10-15 minutos y sedación se controlará mediante reflejo palpable (pizca dedo del pie). Si es necesario durante la cirugía, el 15-20% de la dosis original se puede dar para mantener la anestesia suficiente. Quitar la piel de la cabeza con maquinilla eléctrica. Aproximadamente200% del área de la cirugía debe estar rasurados para prevenir la infección por los pelos. Parte limpia afeitado con providone / yodo (3 veces), seguido de alcohol al 70% (3 veces) antes de la incisión. Cirugía estereotáxica Estereotáxica instrumentos (monitor digital y el marco), perfore micromotor, esterilizador lecho seco y los controladores se deben mantener en una campana de flujo laminar para evitar una posible infección durante el procedimiento de la cirugía en ratas ATN. Una etapa estereotáxica con una almohadilla de calefacción incorporado se puede usar para mantener a los animales calientes durante la cirugía. Hemos utilizado "Kimberly-Clark Safeskin guantes de nitrilo púrpura estéril examen 'thoughout de la cirugía. Estos guantes están envasadas individualmente en una bolsa estéril (cat. n °. 55,093). Además, el cirujano utiliza un 70% spray de alcohol para esterilizar las manos durante la cirugía. Cubrir el animal con una sábana quirúrgica pequeña, con sólo la cabeza al descubierto. La posición de la cabeza del animal con firmeza dentro del marco estereotáxico (indicador de referencia digital, Leica-myNeurolab) mediante la inserción de la oreja baRS en el conducto auditivo externo. Tenga mucho cuidado al deslizar la punta de la barra de oído en el conducto auditivo. Coloque la barra de incisivos enganchando incisivos superiores de la rata y el ajuste de la altura de la barra hasta el punto de referencia estándar, y luego apriete la abrazadera nariz. Centro de la posición de la cabeza entre los barrotes del oído con un mínimo movimiento lateral (± 4 mm) para lograr cero estereotáxica. Después de estos pasos de posicionamiento, se aplican pomada lubricante para evitar la sequedad y protegerlos de posibles derrames o yodo alcohol. Use este ungüento por lo menos dos veces durante la cirugía. Hacer incisión en la piel la línea media (2 cm) a lo largo del cuero cabelludo utilizando bisturí estéril, y limpiar con algodón estéril aplicador con punta. Evitar daños en el caudal y áreas de los músculos del cuello. Mediante el uso de retractor de disección, mantenga abierto el periostio y el tejido blando claro usando un aplicador con punta de algodón mojado en agua oxigenada 1% (hecho en PBS). Para detener el sangrado, mantener una presión firme durante al menos 1 kmn con punta de algodón o gasa aplicador. Aplicar movimiento firme raspado para limpiar el cráneo y el movimiento de la piel frotando hasta que las suturas craneales, bregma y lambda eran visibles. Coordenadas precisas estereotáxica, hace referencia a la bregma, se determinaron utilizando el cerebro de la rata atlas 7. Trasplante de células madre se llevó a cabo en cuatro lugares distintos para cada hemisferio utilizando las coordenadas estereotáxica siguientes: Anterio-posterior (AP) 3,0 mm de bregma, medio-lateral (ML) 1,8 mm de la línea media, y dorso-ventral (DV) de 3,2 mm de la superficie del cerebro. AP, 3,6 mm, ML, de 2,5 mm, DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm, ML, 3,2 mm, DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm, ML, 3,2 mm, DV, 3,2 mm Una vez que el bregma ha sido identificado, las tres coordenadas (AP, ML y DV) debe ser cero en el controlador de visualización digital / (en el marco de estereotáxica digital). A continuación, procederá a marcar los lugares exactos de trasplante (utilizando las coordenadas anteriores) Con un bolígrafo marcador pena de multa al titular de un pequeña sonda en el marco. Perforar un agujero de 0,35 mm (N º 04.01 dental fresa, brocas de carburo de vanadio) a través del cráneo con la taladradora pedal micromotor controlado (Leica-myNeurolab). Tenga cuidado para evitar daños en la membrana dura. Si el sangrado se produce durante la perforación, aplique una presión firme usando un aplicador con punta de algodón. No aplicar alcohol o yodo en el sitio de perforación, ya que esto puede causar irritación a los animales. Las ratas recibieron bilaterales intra-hipocampal inyecciones de una suspensión de NSCs inyectó en un volumen máximo de 1 l con una microjeringa Hamilton 5 l (calibre 30). El número exacto de células dentro de este volumen puede variar de acuerdo a los detalles experimentales. Para lograr esto, la microjeringa fue unido a un soporte de la sonda pequeña en el marco estereotáxico. Con cuidado, inserte la punta de la aguja en el cráneo hasta llegar a la superficie del cerebro (meninges, es decir). En este punto, la coordinación DVte debe ponerse a cero en el controlador de visualización digital /, a continuación, insertar suavemente la aguja hasta la profundidad deseada (DV, 3,2 mm). Espere un minuto antes de iniciar cualquier inyección de células. Inyectar el volumen 0,25 l / min (liberación lenta), utilizando un temporizador. Una vez que un total de 1 l se inyecta, esperar 8 minutos antes de la aguja retráctil en el sitio del trasplante. Después de este tiempo, poco a poco retraer la aguja del lugar de trasplante (0,5 mm / min) para evitar el reflujo capilar de los contenidos de la inyección de nuevo a través del trayecto de la aguja. Siga los pasos 3.2 (jk) para los sitios de trasplante restante (4 por continente). Retire la piel de los retractores del cráneo y el uso de pinzas romo para extraer suavemente la piel y aplicar de nuevo se retractó de 4-5 clips de acero quirúrgico estéril utilizando Autoclips aplicador de sutura (Leica-myNeurolab). Después de retirar el animal del cuadro, se inyectan con analgésicos (buprenorfina, 0,1 mg / kg, sc, cada 12 h) y la solución de Ringer lactato (5 mL/250 rata adulta g, sc). Vuelva a colocar el animal en su jaula que debe mantenerse en una almohadilla térmica. Vigilar el animal hasta que llega a ser consciente antes de regresar a su sala de espera. Coloque un poco humedecido pellets (comida de los animales) y transgel en una placa de Petri por separado en cada jaula para animales. Por otra parte, DietGel recuperación (ClearH 2 O, Portland, ME) se puede utilizar como una fuente de agua y nutrientes. Observar a los animales durante su tiempo de recuperación y aplicar analgesia (buprenorfina 0,02 mg / kg (cada 12 horas durante 2 días). Compruebe si hay signos de dolor, angustia, enrojecimiento o infección del sitio de la cirugía. Aplicar providone / yodo o el ungüento Neosporin una vez al día (hasta las 2 día -3) para prevenir una posible infección. Si existen signos de infección, dolor o malestar persiste después del tratamiento con analgésicos o antibióticos dentro de las 12 horas de cirugía, consulte con un veterinario o personal de cuidado de los animales para obtener más ayuda. 4. Los resultados representativos: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Figura 1. Representación esquemática de nuestro plan experimental. Figura 2. La fusión de TC (anatomía ósea) y la resonancia magnética (tejidos blandos) las imágenes en el software ECLIPSE. Adecuación de las secciones axial, coronal y sagital permitir el co-registro de las características fundamentales anatómicas del cerebro de rata derivados de cada modalidad de imagen. Figura 3. Contorneado regiones del hipocampo del cerebro. Con posterioridad a la fusión de imágenes, hipocampo y el cerebro excluyendo hipocampo se identifican y contorno axial definir determinadas regiones volumétrica para estos órganos. Estas regiones ofrecen información anatómica y el volumen necesario para el ajuste de la distribución de dosis para el objetivo deseado (s). Ure 4 "src =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> Figura 4. Opciones de alta precisión utilizando la radiación de intensidad modulada radioterapia (IMRT) o volumétrica modulada terapia de arco (VMAT) en forma de RapidArc. Estas técnicas ofrecen 6 MV de fotones vigas, ya sea como múltiples trayectorias estáticas que pueden converger en el volumen blanco muy pequeño (IMRT), o dinámicamente a medida que uno o más arcos se centró en la región de destino (RapidArc). Figura 5. Dosis ECLIPSE calcula superpuesto a las imágenes axiales. Las dosis indicadas son para planes de hipocampo de uno o dos de tratamiento de irradiación. Figura 6. ECLIPSE calculada dosis-volumen histograma. Dato contrasta el porcentaje de la irradiación en comparación con el volumen del hipocampo no irradiado en la única hippocplan de ampus tratamiento se muestra en la fig. 5. Figura 7. Posicionamiento de la imagen de rata guía para la radioterapia. Ortogonales digitalmente reconstruida radiografía (RRD) imágenes generadas a partir de los datos de planificación de tratamiento en CT ECLIPSE se fusionan para ortogonal imágenes de rayos X de la rata en la mesa de tratamiento se toma con a bordo de la trilogía de imágenes (OBI) del sistema. El DRR son ponderados en la densidad ósea que destaca el cráneo y otras prominencias óseas que facilitan la co-registro con las imágenes de OBI. Adecuación de estos conjuntos de proporcionar tratamiento cambia posición de la tabla que se debe hacer para lograr el co-registro de la CT y las imágenes de rayos-x. Figura 8. Localización de NSCs trasplantados después de la cirugía estereotáxica. En un mes después del trasplante, los animales fueron perfundidos, el cerebro se sectioned y se tiñeron con BrdU (para detectar NSCs trasplantados) y se tiñeron con hematoxilina contra. El trayecto de la aguja (Nt, línea roja), indica la trayectoria de la inyección que deposita NSCs en el sitio del trasplante de liberación (Tr), justo por debajo del cuerpo calloso (CC) y por encima de la CA1. NSCs trasplantados mostraron extensa migración de Tr en todo el hipocampo host (giro dentado, la Dirección General; hilio dentada, DH, CA1 y CA3 subcampos; x4 magnificación). Barra de escala, a 200 micras.
