Наши экспериментальные план схематически схематически на рисунке 1. 1. Рост и подготовки человеческих нервных стволовых клеток (NSCs) для трансплантации EnStem-клеточной линии (EMD Millipore) была использована в данном исследовании. NSCs регулярно проверяются производителем высокие уровни экспрессии маркеров мультипотентные нестин и Sox2, и низкого уровня экспрессии плюрипотентных маркеров Oct-4, наряду со способностью дифференцироваться в нескольких нейронов фенотипов и поддерживать нормальный кариотип после несколько проходов. В наших условиях роста, эти NSCs отображается обильные выражения Sox2 и нестин и сохранить их способность дифференцироваться, как описано выше 1. NSCs были выращены на поли-L-орнитин (20 мкг / мл) и ламинин (5 мкг / мл), покрытых культуры ткани лечение колб. Клетки выращивали в нейронных среду расширения (Millipore) с добавлением L-глютамин (2 мМ) и базовые фибробластовфактор роста (bFGF, 20 нг / мл). Приверженец монослоев NSCs пассировали через день (1:2) с accutase как агент диссоциации 1. Для исследования трансплантации, NSCs были использованы на местах ниже 10. NSCs были помечены 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU), дополняя питательной среды с 4 мкМ BrdU в течение трех дней перед трансплантацией. Чтобы убедиться в BrdU маркировке индекс (т.е. процент BrdU-положительных клеток), клетки высевают на камеру слайды и обработаны для BrdU обнаружения с использованием стандартных иммуноцитохимического подходов. Клетки использованы для трансплантации регулярно выставлять маркировки индексов более 90% 2. Кроме того, пересаженные стволовые клетки человека были обнаружены с помощью человека конкретным ядерным маркером антигена (HuNu) 2. В день трансплантации, accutase и нейронных СМИ расширения были предварительно нагревали при 37 ° С водяной бане. Клетки были помещены в среду инкубации (нейронные СМИ расширения, содержащий 10 мкМУ-27632) на один час. Y-27632 (ROCK ингибитор, EMD-Calbiochem) было использовано для улучшения выживания NSCs после трансплантации. Через час инкубации средств массовой информации была удалена и клетки обрабатывали accutase течение 5 минут. После этого краткого лечения добавить равное количество нейронных СМИ расширения для нейтрализации accutase и деформации клеток через 70 сито ячейка мкМ. Граф клеток с гемоцитометра и подготовить 1,0 х 10 5 жить NSCs на микролитр в нагнетательной среды (нейронные СМИ расширения, содержащий 10 мкМ Y-27632, 40 нг / мл bFGF, 20 нг / мл BDNF). Клетки хранятся в нейронных СМИ расширения (как описано в 1.5) и держится на льду до момента трансплантации, и должна быть использована в течение 6 часов, чтобы минимизировать гибель клеток при длительном холодном хранении. 2. Лучевая терапия – планирование лечения и облучения Sedated athymic обнаженной крысы (ы) были помещены в лаборатории магнитно-резонансной томографии в лежачем positio п с черепом в верхнем конце (с головой). Это 3 Тл сканер предназначен для сканирования небольших животных. Это может обеспечить изысканный мягких тканей отличие с высоким пространственным разрешением поперечного сечения (осевая) изображения. Сканирования сосредоточены на области черепа и набор из 22 Т2 взвешенных изображениях E60 с 0,8 мм толщиной изображения были получены. Эти изображения предоставляют необходимую информацию для определения левой и правой в гиппокампе мозга крысы. После МРТ (24), животные были седативные [анестезии коктейль (кетамина, 30 мг / кг, ксилазина, 2,5 мг / кг и acepromazine, 1 мг / кг)] и помещен в радиационной онкологии компьютерный томограф, где другой поперечного сечения (осевой) изображение объем был сгенерирован. Крысу помещали в той же или близкой к той же позиции, что и для МРТ и КТ блок был установлен на сканирование черепа региона. Изучение 106 КТ-изображений с толщиной 0,8 мм, изображение было создано который стал КТ данных планирования лечения. Планирование леченияга "> Данные МРТ и КТ изображения были переданы в Eclipse (Varian Medical Systems, Пало-Альто, Калифорния), программное обеспечение планирования лечения с помощью DICOM (цифровой обработки изображений и коммуникации в медицине). ЗАТМЕНИЕ сложные и коммерчески доступного программного обеспечения, используемых в радиационной онкологии для моделирования и дизайна лучший план лучевой терапии для пациента. Она включает в себя орган плотности информации, которая извлекается из данных КТ изображений и используется для расчета распределения дозы радиации в организме. Обложка животных с помощью небольшого хирургического драпировкой только с головы подвергается. Позиция головой животного твердо в стереотаксической рамы (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab), вставляя ухо баров в наружный слуховой проход. Проявляйте особую осторожность при скользящих кончик уха бар в ушной канал. Место бар резца за счет подключения верхних резцов крыс и корректировки бар высота стандартной точки отсчета, затем затяните нос зажим. Центр позицииголовы между ухом баров с минимальным боковым движением (± 4 мм) для достижения стереотаксической нулю. Следующим шагом в процессе является определение облучения техника будет использоваться. Интенсивность модулированных лучевой терапии (IMRT) и объемно-модулированного дуги терапии (VMAT) в виде RapidArc находятся 2 высокоточного облучения методы, которые используют 6 М. В. фотонного пучка доставить дозу облучения 3-6. Разница между этими методами является то, что IMRT обеспечивает дозу, используя несколько статических траекторий каждый из которых соответствует различным направлении, но сходятся на целевом томе больше подходит для очень небольших объемах цели. RapidArc с другой стороны, обеспечивает дозу динамически через один или несколько дуг направлены на целевые области (рис. 4). Независимо от того, поставка техники, информация о целевой дозы, целевые соответствия и граничные дозы для критических органов должны быть введены в окне дозы оптимизации ECLIPSE. Тего информации, наряду с органом объемах используется адаптировать распределение дозы, которая достигается за счет постоянного изменения ослабления пучка в процессе облучения. После того, как план был сгенерирован, Eclipse предоставляет расчетная доза наложенными на осевые, корональной и сагиттальной изображений (рис. 5), а также в дозе объема гистограммы (DVH) формат (рис. 6). Именно в этот момент, когда план должен быть оценен, чтобы определить, подходит для доставки или нуждается в улучшении. Облучение процесса После того, как план был одобрен для доставки, цифровой реконструирован рентгенограмме (СРБ) Изображения получены в результате обработки данных КТ планирования в ECLIPSE. Эти ортогональных изображений взвешенный на плотность костной ткани, чтобы выделить черепа и другие костлявые ориентиры. После этого план лечения и ЦРРС отправляются на компьютер лечения системы доставки через DICOM. Система доставки контроля Varian Трилогия линейного ускорителя нormally используется для лучевой терапии человека. Ускоритель оснащен 120 с компьютерным управлением тонкой коллиматоров multileaf (ДОК) и диагностические качества рентгеновского изображения системы включены в бортовой съемочной (OBI) системы. Эта система доставки добавления ECLIPSE конкретной информации и перенастраивает параметры коллиматора в ускорителе для доставки запланированных доз. В этот момент крыса была подготовлена для облучения, седативные и покрытые бумаги одеяло, чтобы он оставался в тепле. Через несколько минут, крыса, с ее одеялом, но с черепом разоблачены, был помещен на лечение таблице в том же положении, используются для создания компьютерной томографии. Это очень важный шаг, потому что точность определения местоположения напрямую коррелирует с точностью в дозе доставки. Как только крыса была расположена должным образом на лечение стол, набор ортогональных рентгеновских изображений, сделанные с использованием системы ОБИ трилогии. Эти изображения с высоким разрешением, которые впоследствии были слиты с ECLIPSE генерироватьг ЦРРС использованием слияния OBI образ программного обеспечения. Рентгеновские снимки и были ЦРРС цифровой соответствие с использованием программного обеспечения, которые предоставляют информацию по таблице положение изменения, которые должны быть сделаны для достижения ко-регистрация изображений (рис. 7). После анализа этой информации и проверки того, что результирующая сдвиги случайно не привести в какой-либо столкновений между ускорителем и лечения стол, компьютер относится сдвиги и лечения стол движется автоматически в нужное положение. В этот момент облучения начинается. Для доставки доза 10 Гр с 6-поля план IMRT, пучка по времени составляет около 10 минут, пока две дуги RapidArc занимает ~ 3 минуты. После лечения поставка завершена, крыса была удалена из процедурный кабинет и позволил восстановить в проведении клетке хранится на грелку. 3. Стереотаксической хирургии для внутри-гиппокампа трансплантации стволовых клеток человека nimals хозяйства и хирургической подготовки Для этого исследования мы использовали два месяца старых крыс ATN, приобретенные у Национального института рака (штамм 0N01 Cr: NIH-РНЕ). Животные находились в стерильных клетках и сохраняется в температуре и малой контролируемой барьер-среде с 12-h/12-h светлый / темный цикла. Крысы были предоставлены автоклавного продукты питания и воду без ограничений рекламы и были приняты меры для предотвращения инфекции глаз, очищая глаза каждую неделю с Vetropolycin глазная мазь (Западная Medical Supply, Аркадия, Калифорния). Для стереотаксической хирургии, крыс под наркозом с IP-инъекции анестезии коктейль (кетамина, 30 мг / кг, ксилазина, 2,5 мг / кг и acepromazine, 1 мг / кг). Полное обезболивание было вызвано через 10-15 минут и седативный эффект контролировать с помощью ощутимой рефлекса (носок щепотку). При необходимости во время операции, 15-20% от первоначальной дозы могут быть предоставлены для поддержания достаточного обезболивания. Удалить мех с головы с помощью электрических клиперов. Приблизительно200% от хирургии область должна быть бритой, чтобы предотвратить заражение волосков. Чистая бритой части использования providone / йода (3 раза), а затем на 70% спирте (3 раза) до разреза. Стереотаксической хирургии Стереотаксических инструментов (цифровой монитор и рамка), микромотор дрель, сухой стерилизатор кровать и контроллеры должны храниться в ламинарном боксе, чтобы предотвратить возможное заражение во время операции процедуры у крыс АТН. Стереотаксической сцене с встроенным грелки могут быть использованы для держать животных теплой во время операции. Мы использовали «Кимберли-Кларк Safeskin Фиолетовый нитрил стерильные перчатки экзамен" thoughout хирургии. Эти перчатки отдельно упакованные в стерильный пакет (кат. нет. 55093). Кроме того, хирург использовали 70% спирта спрей для стерилизации рук во время операции. Обложка животных с помощью небольшого хирургического драпировкой только с головы подвергается. Позиция головой животного твердо в стереотаксической рамы (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab), вставляя ухо баRS в наружный слуховой проход. Проявляйте особую осторожность при скользящих кончик уха бар в ушной канал. Место бар резца за счет подключения верхних резцов крыс и корректировки бар высота стандартной точки отсчета, затем затяните нос зажим. Центр положение головы между ухом баров с минимальным боковым движением (± 4 мм) для достижения стереотаксической нулю. После этих шагов позиционирования, применять смазочные глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание и защитить их от возможных йодом или спиртом разливов. Используйте эту мазь не менее 2 раз во время операции. Сделать средней линии разрез кожи (2 см), а также кожу головы стерильные скальпель, и чистых использованием стерильных хлопка наконечником аппликатором. Избегайте повреждения в хвостовой и мышц шеи областях. При использовании рассекает втягивающим, удерживая надкостницы открытым и ясным мягких тканей с помощью ватного аппликатора наконечником, смоченным в 1% перекиси водорода (производство PBS). Чтобы остановить кровотечение, поддерживать сильное давление, по крайней мере 1 милиN Использование хлопка наконечником аппликатором или марлей. Применить фирмы выскабливание движения для очистки черепа и вытирая движения для кожи до черепа швов, брегмы и лямбда были видны. Точное стереотаксической координаты, ссылки на темя, определяли с помощью головного мозга крыс атлас 7. Трансплантация стволовых клеток было сделано на четыре отдельных сайтов для каждого полушария, используя следующий стереотаксической координаты: Anterio-задней (AP) 3,0 мм от брегмы, средне-боковое (ML) 1,8 мм от средней линии, и дорзо-вентральной (DV) 3,2 мм от поверхности мозга. А. П., 3,6 мм; М.Л., 2,5 мм; DV, 3,2 мм А. П., 4,2 мм; М.Л., 3,2 мм; Д.В., 3.2mm А. П., 4,2 мм; М.Л., 3,2 мм; Д.В., 3.2mm После брегмы был определен, все три координаты (А. П., М. Л. и Д. В.) должны быть обнулены на цифровой дисплей / контроллер (на цифровой стереотаксической рамы). Затем переходите к случаю точной сайтов трансплантации (используя выше координатам) С прекрасным маркером точку прилагается к небольшим держателем зонда на раме. Дрель 0,35 мм отверстие (№ 1 / 4 стоматологические заусенцев, карбид ванадия биты сверла) через череп помощью ножной педали контролируемой дрель микромотор (Leica-myNeurolab). Позаботьтесь, чтобы предотвратить повреждение мембраны оболочки. Если кровотечение возникает во время бурения, применять сильное давление с помощью ватного наконечником аппликатором. Не применять спирт или йод на буровой, так как это вызовет раздражение животных. Крысы получил двусторонних внутри гиппокампа инъекции суспензия вводится в NSCs максимальный объем 1 мкл с использованием 5 мкл Hamilton микрошприца (30 калибр). Точное число клеток в течение этого объема будет меняться в зависимости от экспериментальных особенностей. Чтобы достичь этого, микрошприца была присоединена к небольшой держатель зонда на стереотаксической рамы. Осторожно вставьте кончик иглы в череп до достижения поверхности мозга (т.е. мозговых оболочек). На данный момент, Д. В. координационнойТе должны быть обнулены на цифровой дисплей / контроллер, затем аккуратно вставить иглу на необходимую глубину (DV, 3,2 мм). Подождите 1 мин до начала любой инъекции клеток. Inject 0,25 мкл / мин (медленного высвобождения) с помощью таймера. После всего 1 мкл вводят, подождите 8 минут до втягивания иглы с сайта трансплантации. По истечении этого времени, медленно отведите иглу с сайта трансплантации (0,5 мм / мин) для предотвращения капиллярного рефлюкс инъекции содержимое обратно через иглу трек. Выполните шаги 3.2 (JK) для остальных трансплантации сайтов (4 в полушарии). Снимите кожу с втягивающим черепа и использовать тупой пинцет, чтобы аккуратно вытяните назад отказался от кожи и нанесите 4-5 стерильные зажимы из нержавеющей использованием Autoclips хирургический шов объекта применения (Leica-myNeurolab). После удаления животного из кадра, придать с обезболивающим (Buprenorphin, 0,1 мг / кг, подкожно каждые 12 часов) и лактата раствор Рингера (5 mL/250 г взрослой крысы, подкожно). Место животное обратно в клетку, которая должна храниться на грелку. Монитор животное, пока не осознает, прежде чем вернуться к его проведению комнате. Поместите некоторые смоченной гранул (животное чау) и transgel в отдельной чашке Петри у каждого животного клетки. Кроме того, DietGel Recovery (ClearH 2 O, Portland, ME) может быть использован как источник воды и питательных веществ. Монитор животных в процессе их время восстановления и применять обезболивание (бупренорфин 0,02 мг / кг (каждые 12 ч в течение 2 дней). Проверьте на наличие признаков боль, душевные страдания, покраснение или инфекции хирургии сайта. Применить providone / йодом или мазью Neosporin один раз в сутки (до 2 -3 дней), чтобы предотвратить возможные инфекции. Если какой-либо признаков инфекции, боль или страдание сохраняются следующие анальгетиков или лечения антибиотиками в течение 12 часов после операции, консультации ветеринара или персонал по уходу за животными для дальнейшей помощи. 4. Представитель результаты: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Рисунок 1. Схематическое изображение нашего экспериментального плана. Рисунок 2. Fusion КТ (костные анатомия) и МРТ (мягких тканей) изображений в программном обеспечении ECLIPSE. Согласование осевые, корональной и сагиттальной разделы позволяют совместно реестр критических анатомических особенностей головного мозга крыс производным от каждого изображения модальности. Рисунок 3. Контурные гиппокампа регионах мозга. После слияния изображений, гиппокампе мозга и гиппокампе исключая определены и контуры аксиально определении удельного объемного регионов для этих органов. Эти регионы обеспечивают анатомическую и объем информации, необходимой для регулирования распределения дозы в районе цели (ы). Юр 4 "SRC =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> Рисунок 4. Высокая точность облучения вариантов с использованием интенсивность-модулированных лучевой терапии (IMRT) или объемно-модулированного дуги терапии (VMAT) в виде RapidArc. Эти методы доставки 6 М. В. фотонных пучков либо в виде нескольких статических траекторий, которые могут сходиться на очень малых объемах мишени (IMRT), или динамически, как одна или несколько дуг сосредоточены на целевом регионе (RapidArc). Рисунок 5. ECLIPSE расчетные дозы накладывается на осевые изображения. Дозы указаны для одного или двух планах гиппокампе облучения лечение. Рисунок 6. ECLIPSE расчетная доза-объем гистограммы. Данные контрастах процент по сравнению с облученным необлученных объема гиппокампа под единым hippocampus план лечения показано на рис. 5. Рисунок 7. Изображение крысы руководствуются позиционирования для лучевой терапии. Ортогональные цифровой реконструирован рентгенограмме (СРБ) изображения полученные от лечения КТ плановых данных в ECLIPSE слиты ортогональным рентгеновских изображений крыс на лечение таблице приняты с бортовыми трилогии томография (OBI) системы. ЦРРС взвешиваются на плотность костной ткани, которая подчеркивает черепа и другие костлявые ориентиры, которые облегчают совместное регистрации OBI изображений. Согласование этих множеств обеспечить лечение таблице положение изменения, которые должны быть сделаны для достижения ко-регистрация КТ и рентгеновские снимки. Рисунок 8. Расположение пересаженных NSCs следующие стереотаксической хирургии. На 1-месяц после трансплантации, животные были перфузии, мозги были sectioneг и окрашивали BrdU (для выявления пересаженных NSCs) и счетчик, окрашенных гематоксилином. Иглой дорожки (Nt, красная линия), указывает на инъекции траектории, хранение NSCs при пересадке-релиз сайта (Тр), чуть ниже мозолистого тела (CC) и выше СА1. Пересаженные NSCs показали обширные миграции из Тр всей хост гиппокампе (зубчатой извилине, Д. Г.; зубчатой хилус, DH; СА1 и СА3 подполей; увеличение x4). Шкала бар, 200 мкм.
