식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

1. 식물 재료의 Crosslinking 하베스트 1~2g Arabidopsis 50 – ML 플라스틱 튜브에 단풍 (6 10cm의 로제트 직경에) 및 crosslinking 버퍼와 40mL까지 기입니다. 단풍이 버퍼 표면 위에 맞춤형 필터 스폰지 권리를 때우는하여 예를 들어, 포장되어있어 있는지 확인합니다. 다음 건조기에 튜브를 삽입합니다. 진공은 10 분에 대한 침투. 각 튜브는 crosslinking를 중지 2M 글리신의 2.5mL를 추가하고, 글리신의 동일한 분산을 보증하기 위해 튜브를 반전. 진공 다른 5 분에 대한 침투와 체에 잎을 수확하는 동안 액체를 폐기하십시오. 워시는 다음 유리 비커에 물 1L, 철저하게 종이 타올로 건조 잎 두 잎. 새로운 플라스틱 튜브에 잎사귀를 수집하고 액체 질소에 냉동. 스토어 -80 시에 출발 ° C까지 염색질 절연. 2. 염색질의 분리 단풍은 사용까지 액체 질소에 보관되었습니다 박격포와 암술과 지상되었습니다. 50 – ML 플라스틱 튜브에 분말을 전송하고 30mL 추출 버퍼 # 1 일시 중지합니다. 오버헤드 흔드는에 4 ° C에서 15 분에 대해 품어. 새로운 50 ML 플라스틱 튜브에 miracloth 네 가지 레이어를 통해 여과물 서스펜션. 4 2,800 XG에서 20 분에 대한 회전 ° C. 뜨는 제거하고 1mL 추출 버퍼 # 2에서 페인트 브러시와 펠렛을 일시 중지합니다. 처음엔 페인트 브러시와 펠렛을 중지하고 버퍼의 나머지 부분을 추가, 버퍼 # 2의 작은 볼륨을 추가합니다. 4 12,000 XG에서 10 분에 1.5mL microfuge 관과 스핀으로 정지를 전송 ° C. 한편, 1.5mL 추출 버퍼 # 3를 포함하는 2mL – microfuge 튜브를 준비합니다. 스펀 튜브 (2.7 단계)에서 뜨는 제거하고 추출 버퍼 # 3 300μL의 펠렛을 일시 중지합니다. 첫째, 버퍼 # 3의 작은 볼륨을 추가 페인트 브러시와 펠렛을 중지하고 나머지 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 pipet 단계 2.8 준비 1.5 ML 추출 버퍼 # 3 위에 펠렛을 (단계 2.9) 중지. 두 단계가 혼합되지 않습니다 있는지 확인합니다. 4 16,000 XG에서 1 시간을 위해 스핀 ° C. 뜨는 제거하고 sonication 버퍼의 300μL의 페인트 브러시와 염색질 펠렛을 일시 중지합니다. 약 400bp의 DNA를 크기에, sonotrode와 함께, 또는 초음파 욕조에서 염색질을 Sonicate. sonicating 때, 반드시 염색질이 약 30 이상 가열되지 않습니다 ° C는 열에 민감한 crosslinks를 보호하기 위해합니다. sonication의 기간은 다른 sonication 장치 사이에 상당히 차이가 있기 때문에, 실험적으로 결정되어야합니다. 지도 들어, 두 개의 다른 장치에 대한 설정이 제공됩니다 : 0.6mL microfuge 튜브에 Bandelin 브랜드 sonotrode 노출 염색질 25 % 파워 사이클 = 50 설정으로 다섯 번 20 파열과 sonication하십시오. 얼음 욕조에 매 20 번째 파열 후에 이렇게하는 동안, 쿨 샘플. Diagenode Bioruptor 초음파 욕조와 sonication을 위해, 물, 얼음 욕조를 입력하고 '높음'설정을 1.5mL microfuge 튜브에서 30 초 동안 열번 sonicate. 매 30 초 후에 다른 30 ​​초 동안 냉각 샘플. 스핀은 4 1만6천g에서 5 분에 대한 샘플을 sonicated ° C 소화 되 다만 자료를 촉진합니다. 뜨는 직접 immunoprecipitation 사용할 수 있습니다. 또한, 샘플은 액체 질소에 냉동과 ° C까지 추가로 사용하여 -80에 저장된 충격하실 수 있습니다. 3. Immunoprecipitation 40μL 단백질 – 항체 결합 버퍼의 아가로 오스와 1.8mL.을 포함하는 2 – ML의 microfuge 튜브 준비 염색질의 준비 200μL (2.13 단계)를 추가합니다. 오버헤드 흔드는에 1 시간을위한 튜브를 품어. 단백질 – 아가로 오스 비즈를 버리고 immunoprecipitation을위한 뜨는 사용합니다. 염색질 농도를 ( '입력')를 확인하는 40μL – 나누어지는을 제거합니다. 추가 30μL 단백질 – 아가로 오스와 400μL sonicated 염색질 서스펜션에 특정 시약 및 장비의 아래 테이블에 표시됩니다 수정 – 특정 항체의 금액입니다. 4 오버헤드 흔드는에 2.5h 또는 야간에 대해 품어 ° C. 440 X G.에서 2min을 위해 구슬을 스핀 각 세척 버퍼 900μL (아래 목록 참조) 비드 펠렛 씻으십시오. 각 버퍼 들어, 4 오버헤드 흔드는 ° C에 10 분에 대한 버퍼에 품어 구슬 다음, 440 XG에서 2min에 대한 스핀 뜨는 삭제하고 다음 버퍼를 추가합니다. 낮은 소금 세척 버퍼 고 염분 세척 버퍼 LiCl 세척 버퍼 TE 세척 버퍼 최종 세척 후 완전히 남아있는 버퍼를 제거합니다. 4. histones과 DNA의 드 – crosslinking, 그리고 시켰던 DNA의 정화 아가로 오스 펠렛 및 단계 3.4에서 40μl '입력'샘플, 소용돌이 믹서에서 5 분을위한 혼합, 회전 샘플 및 incu에 드 crosslinking 버퍼 100μL 추가° C 야간 65 덜다. 상업 DNA 또는 PCR 정화 키트와 함께 DNA 정화. 일반적으로 최종 열 eluate의 1시 5분 희석의 5μl가 수행하는 충분 기존의 현장 특정 실시간 정량 RT – PCR (RT – qPCR). 5. 버퍼 표 Crosslinking 버퍼 나트륨 butyrate 10mM 자당 400mM 트리스 – HCL, pH를 8.0 10mM β – 메르 캅 토 에탄올 5mM 포름 알데히드 3퍼센트 (V / V) 추출 버퍼 # 1 나트륨 butyrate 10mM 자당 400mM 트리스 – HCL, pH를 8.0 10mM β – 메르 캅 토 에탄올 5mM 완료 테아제 억제제 1X 추출 버퍼 # 2 나트륨 butyrate 10mM 자당 250mM 트리스 – HCL, pH를 8.0 10mM β – 메르 캅 토 에탄올 5mM MgCl 2 10mM 트리톤 X – 100 1퍼센트 (W / V) 완료 테아제 억제제 1X 추출 버퍼 # 3 나트륨 butyrate 10mM 자당 1.7M 트리스 – HCL, pH를 8.0 10mM β – 메르 캅 토 에탄올 5mM MgCl 2 2mM 트리톤 X – 100 0.15 % (W / V) 완료 테아제 억제제 1X Sonication 버퍼 트리스 – HCL, pH를 8.0 25mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – NaOH, pH를 8.0 5mM SDS 0.5 % (W / V) 완료 테아제 억제제 1X 항체 결합 버퍼 트리스 – HCL, pH를 8.0 50mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – NaOH, pH를 8.0 1mM NaCl 150mM 트리톤 X – 100 0.1 % (W / V) 낮은 소금 세척 버퍼 NaCl 150mM SDS 0.1 % (W / V) 트리톤 X – 100 1퍼센트 (W / V) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – NaOH, pH를 8.0 2mM 트리스 – HCL, pH를 8.0 20mM 고 염분 세척 버퍼 NaCl 500mM SDS 0.1 % (W / V) 트리톤 X – 100 1퍼센트 (W / V) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – NaOH, pH를 8.0 2mM 트리스 – HCL, pH를 8.0 20mM LiCl 세척 버퍼 염화 리튬 250mM Nonidet – P40 1퍼센트 (V / V) 나트륨 desoxycholate 1퍼센트 (W / V) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – NaOH, pH를 8.0 1mM 트리스 – HCL, pH를 8.0 20mM TE 세척 버퍼 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – NaOH, pH를 8.0 10mM 트리스 – HCL, pH를 8.0 1mM Decrosslinking 버퍼 트리스 – HCL, pH를 6.8 62.5mM NaCl 200mM SDS 2퍼센트 (W / V) DTT 10mM 6. 대표 결과 : Arabidopsis thaliana PR2 방어 유전자 표현 β를 인코딩항균 활성 12과 1,3 – 글루 카 네이스는 benzothiadiazole (BTH), 식물 호르몬 살리실산 3 합성 아날로그에 의해 유발되었다. 그림 1 PR2 표현의 활성화를 보여줍니다 히스톤에 리신 잔류물의 아세틸화 증가와 관련된 PR2 모터에 H3 및 H4. nucleosome 밀도는 유전자 활성화 13시 감소 때문에, 히스톤 아세틸화 값 히스톤 3 불변량 지역 항체로 얻은 신호 표준되었습니다. 그림 1 BTH는 Arabidopsis에 PR2 모터에 히스톤 아세틸화을 유도. 식물은 100μM BTH 또는 wettable 분말 컨트롤과 함께 치료를했다. 72h 후, 단풍이 수집되었고 염색질은 고립되었다. 아세틸화 특정 항체 (같은 그림에 표시된)와 강수량 후 얻은 신호는 히스톤 H3의 불변량 도메인에 항체와 석출하여 얻은 신호 표준되었습니다. 시켰던 염색질은 RT – qPCR에 의해 계량했다. 데이터 BTH 치료의 부재에서 히스톤 수정 수준 표준화하고 있습니다.