Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

1. Reticolazione del materiale vegetale Vendemmia 1-2g di foglie di Arabidopsis (6 a 10cm di diametro rosetta) in una da 50 ml tubo di plastica e riempire fino a 40ml di buffer di reticolazione. Assicurarsi che lascia soggiorno immerso, ad esempio ripieno un diritto su misura spugna filtro sopra la superficie del buffer. Poi posto i tubi in un essiccatore. Vuoto infiltrarsi per 10min. Per aggiungere ogni tubo 2,5 ml di glicina 2M per fermare reticolazione, e invertire i tubi per garantire la dispersione pari della glicina. Vuoto infiltrarsi per altri 5 minuti e scartare fluido durante la raccolta foglie su un setaccio. Lavare le foglie due volte con 1 litro di acqua in un bicchiere di vetro, poi lascia asciugare con salviette di carta. Raccogliere le foglie in un tubo di plastica fresca e congelare in azoto liquido. Conservare le foglie a -80 ° C fino isolamento cromatina. 2. Isolamento di cromatina Foglie a terra con malta e pistillo che sono stati mantenuti in azoto liquido fino al momento dell'uso. Trasferimento in polvere ad un 50-ml tubo di plastica e sospendere in tampone di estrazione 30mL # 1. Incubare per 15 minuti a 4 ° C su un overhead shaker. Sospensione filtrato attraverso quattro strati di miracloth in un nuovo 50-ml tubo di plastica. Spin per 20 minuti a 2800 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e sospendere pellet con un pennello a tampone di estrazione 1mL # 2. In primo luogo aggiungere un piccolo volume di tampone # 2, poi sospendere pellet con un pennello, e quindi aggiungere il resto dei buffer. Trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C. Nel frattempo, preparare 2 ml-microcentrifuga provette contenenti 1,5 ml di buffer di estrazione # 3. Rimuovere il surnatante dal tubo filato (passo 2,7) e sospendere pellet in 300μL di tampone di estrazione # 3. In primo luogo aggiungere un piccolo volume di tampone # 3, sospendere pellet con un pennello, e quindi aggiungere il buffer residuo. Con attenzione pipetta precipitato sospeso (passo 2,9) in cima al buffer di 1,5 ml di estrazione n. 3 preparati in fase 2.8. Assicurarsi che le due fasi non si mescolano. Spin per 1h a 16000 xga 4 ° C. Rimuovere il surnatante e sospendere cromatina pellet con un pennello in 300μL di buffer di sonicazione. Ultrasuoni cromatina con un sonotrodo, o in un bagno a ultrasuoni, a una dimensione del DNA di circa 400bp. Quando sonicating, fare cromatina che non sarà una temperatura superiore di circa 30 ° C per proteggere sensibili al calore legami crociati. La durata di sonicazione deve essere determinato sperimentalmente, perché varia in modo significativo tra i diversi dispositivi di sonicazione. Per la guida, le impostazioni per i due dispositivi differenti: Per sonicazione con un marchio Bandelin sonotrodo esporre cromatina in tubo di 0,6 ml microcentrifuga cinque volte a 20 scatti con impostazioni 25% di energia, ciclo = 50. Così facendo, fresco campione ogni 20 scoppia ° in un bagno di ghiaccio. Per sonicazione con vasca Diagenode Bioruptor ultrasuoni, riempire bagno con acqua e ghiaccio e sonicare dieci volte per 30 secondi in tubi microcentrifuga 1,5 ml con l'impostazione 'alta'. Dopo ogni 30 secondi, i campioni di raffreddare per altri 30 secondi. Spin sonicato campione per 5 min a 16.000 g a 4 ° C a precipitare materiale non disciolto. Il supernatante possono essere utilizzati direttamente per immunoprecipitazione. In alternativa, i campioni possono essere scossa congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino a quando un ulteriore uso. 3. Immunoprecipitazione Preparare 2-mL tubi da microcentrifuga contenente 40μL proteina-A agarosio e 1.8mL di anticorpi di legame buffer. Aggiungere 200μL della preparazione cromatina (passo 2.13). Incubare le provette per 1 ora su un overhead shaker. Eliminare le proteine-A perline agarosio e l'utilizzo sopranatante per immunoprecipitazione. Rimuovere un 40μL-aliquota per determinare la concentrazione della cromatina ('ingresso'). Aggiungi 30μL proteina-A agarosio e la quantità di modifica anticorpo specifico che è indicato nella tabella sottostante di reagenti e attrezzature specifiche per 400μL sospensione cromatina sonicato. Incubare per 2.5 ore o durante la notte su una lavagna luminosa agitatore a 4 ° C. Spin down perline per 2min a 440 x g. Lavare tallone pellet con 900μL di ogni tampone di lavaggio (vedi elenco sotto). Per ogni buffer, perline incubare nel buffer per 10 minuti su un agitatore in testa a 4 ° C, poi girare per 2 minuti a 440 xg, scartare il surnatante e aggiungere il buffer successivo. Iposodica tampone di lavaggio Alta sale tampone di lavaggio LiCl tampone di lavaggio TE tampone di lavaggio Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere completamente qualsiasi residuo di buffer. 4. De-reticolazione degli istoni e del DNA, e la purificazione del DNA precipitato Aggiungere 100μL di de-reticolazione tampone al pellet agarosio e il campione 'ingresso' il 40μl dal punto 3.4, mescolare per 5 min su un vortex, campioni di spin, e incubatoribate a 65 ° C durante la notte. Purificare il DNA con il DNA commerciale o kit di purificazione PCR. Tipicamente 5μl di una diluizione 1:5 del eluato della colonna finale sono sufficienti per eseguire convenzionali locus-specifiche real-time RT-PCR quantitativa (RT-qPCR). 5. Tabella dei buffer Reticolazione tampone Butirrato di sodio 10mM Saccarosio 400mm Tris-HCl, pH 8,0 10mM β-mercaptoetanolo 5mM Formaldeide 3% (v / v) Tampone di estrazione # 1 Butirrato di sodio 10mM Saccarosio 400mm Tris-HCl, pH 8,0 10mM β-mercaptoetanolo 5mM Inibitori della proteasi completo 1x Tampone di estrazione # 2 Butirrato di sodio 10mM Saccarosio 250mm Tris-HCl, pH 8,0 10mM β-mercaptoetanolo 5mM MgCl 2 10mM Triton X-100 1% (w / v) Inibitori della proteasi completo 1x Tampone di estrazione # 3 Butirrato di sodio 10mM Saccarosio 1.7M Tris-HCl, pH 8,0 10mM β-mercaptoetanolo 5mM MgCl 2 2mM Triton X-100 0,15% (w / v) Inibitori della proteasi completo 1x Sonicazione tampone Tris-HCl, pH 8,0 25mM NaOH-EDTA, pH 8,0 5mM SDS 0,5% (w / v) Inibitori della proteasi completo 1x Anticorpi tampone vincolante Tris-HCl, pH 8,0 50mM NaOH-EDTA, pH 8,0 1 mM NaCl 150mm Triton X-100 0,1% (w / v) Iposodica tampone di lavaggio NaCl 150mm SDS 0,1% (w / v) Triton X-100 1% (w / v) NaOH-EDTA, pH 8,0 2mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM Alta sale tampone di lavaggio NaCl 500mm SDS 0,1% (w / v) Triton X-100 1% (w / v) NaOH-EDTA, pH 8,0 2mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM LiCl tampone di lavaggio Cloruro di litio 250mm Nonidet-P40 1% (v / v) Sodio desossicolato 1% (w / v) NaOH-EDTA, pH 8,0 1 mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM TE tampone di lavaggio NaOH-EDTA, pH 8,0 10mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM Decrosslinking tampone Tris-HCl, pH 6.8 62,5 mm NaCl 200mm SDS 2% (w / v) DTT 10mM 6. Rappresentante dei risultati: Espressione del gene di Arabidopsis thaliana difesa PR2 che codifica per una β-1,3-glucanasi con attività antimicrobica 12, è stata indotta da benzothiadiazole (BTH), un analogo sintetico del ormone vegetale acido salicilico 3. Figura 1 dimostra che l'attivazione di PR2 espressione è associata ad un aumento della acetilazione degli istoni su residui di lisina H3 e H4 sul promotore PR2. Dal momento che la densità nucleosoma diminuisce durante l'attivazione del gene 13, i valori acetilazione degli istoni sono stati normalizzati per il segnale ottenuto con un anticorpo ad una regione invariante di istone 3. Figura 1 BTH induce l'acetilazione degli istoni sul promotore PR2 in Arabidopsis. Le piante sono state trattate con BTH 100μM o un controllo in polvere bagnabile. Dopo 72 ore, le foglie sono state raccolte e cromatina è stato isolato. Il segnale ottenuto dopo precipitazione con acetilazione anticorpi specifici (come indicato in figura) è stata normalizzata per il segnale ottenuto per precipitazione con un anticorpo a un dominio invariante dell'istone H3. Cromatina precipitato è stata quantificata mediante RT-qPCR. I dati sono standardizzati per livelli di modificazione degli istoni, in assenza di trattamento BTH.