Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

1. Verknoping van plantmateriaal Oogst 1-2g van Arabidopsis bladeren (6 tot 10cm rozet diameter) in een 50 ml plastic buisje en vul tot 40 ml met de verknoping buffer. Zorg ervoor dat bladeren blijven ondergedompeld, bijvoorbeeld door het vullen een op maat gemaakte filter spons recht boven buffer oppervlak. Plaats dan buizen in een exsiccator. Vacuüm infiltreren voor 10min. Aan elke buis 2,5 ml toe te voegen van 2M glycine tot verknoping te stoppen en omkeren buizen op gelijke spreiding van glycine rechtvaardigen. Vacuüm infiltreren voor een ander 5min en gooi vloeistof tijdens het oogsten bladeren op een zeef. Was de bladeren tweemaal met 1 liter water in een bekerglas, dan droge bladeren grondig met papieren handdoeken. Verzamel bladeren in een nieuwe plastic buis en vriezen in vloeibare stikstof. Bewaar vertrekt bij -80 ° C tot chromatine isolatie. 2. Isolatie van chromatine Bladeren werden grond met mortel en stamper die in vloeibare stikstof bewaard tot gebruik. Overdracht poeder om een ​​50-mL plastic buis en schorten 30 ml extractiebuffer # 1. Incubeer 15 minuten bij 4 ° C op een overhead shaker. Filtraat ophanging door middel van vier lagen van miracloth in een verse 50-mL plastic buis. Spin voor 20min bij 2.800 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en schorten pellet met een kwast in 1 ml extractiebuffer # 2. Voeg eerst een klein volume van de buffer # 2, en dan pellet te schorten met een kwast, en voeg vervolgens de rest van de buffer. Overdracht vering om een ​​1,5 ml microfugebuis en spin voor 10min bij 12.000 xg bij 4 ° C. Ondertussen bereiden 2 ml-microfugebuizen buisjes met 1,5 ml extractiebuffer # 3. Verwijder het supernatans van de gesponnen buis (stap 2.7) en te schorten pellet in 300μL extractiebuffer # 3. Voeg eerst een klein volume van de buffer # 3, te schorsen pellet met een kwast, en voeg de resterende buffer. Voorzichtig pipet de gesuspendeerde pellet (stap 2.9) op de top van de 1,5 mL extractiebuffer # 3 bereid in stap 2.8. Zorg ervoor dat de twee fasen zal niet mengen. Spin voor 1 uur bij 16.000 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en schorten chromatine pellet met een kwast in 300μL van ultrasoonapparaat buffer. Sonificeer chromatine met een sonotrode, of in een ultrasoon bad, om een ​​DNA-grootte van ongeveer 400bp. Wanneer sonicating, zorg ervoor dat chromatine niet verwarmd boven ongeveer 30 ° C tot warmtegevoelige crosslinks te beschermen. De duur van ultrasoonapparaat moet experimenteel worden bepaald, omdat deze varieert aanzienlijk tussen verschillende ultrasoonapparaat apparaten. Voor begeleiding, zijn de instellingen voor twee verschillende apparaten op voorwaarde dat: Voor ultrasoonapparaat met een Bandelin merk sonotrode bloot chromatine in 0,6 ml microfugebuis vijf keer tot 20 barst met instellingen 25% vermogen, cyclus = 50. Terwijl u dit doet, koele monster na iedere 20 ste barst in een ijsbad. Voor ultrasoonapparaat met een Diagenode Bioruptor ultrasoonbad, vul bad met water en ijs en ultrasone trillingen tien keer gedurende 30 seconden in 1,5 ml microfuge tubes met het instellen van 'hoog'. Na elke 30 seconden, koele monsters voor nog eens 30 seconden. Spin gesoniceerd steekproef voor 5 min bij 16.000 g bij 4 ° C voor het neerslaan van onopgelost materiaal. Het supernatant kan direct gebruikt worden voor de immunoprecipitatie. Als alternatief kan monsters shock ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot verder gebruik. 3. Immunoprecipitatie Bereid 2-mL microfugebuizen buisjes met 40μL proteïne-A agarose en 1.8mL van antilichaam-binding buffer. Voeg 200μL van het chromatine voorbereiding (stap 2,13). Incubeer buizen voor 1 uur op een overhead shaker. Gooi proteïne-A-agarose parels en te gebruiken voor het supernatant immunoprecipitatie. Verwijderen van een 40μL-hoeveelheid aan chromatine concentratie ('input') te bepalen. Voeg 30μL proteïne-A agarose en de hoeveelheid van wijziging-specifieke antilichaam dat wordt aangegeven in de onderstaande tabel van specifieke reagentia en apparatuur om 400μL gesoniceerd chromatine schorsing. Incubeer 2.5u of 's nachts op een overhead-schudder bij 4 ° C. Spin down kralen voor 2min op 440 x g. Was kraal pellet met 900μL van elke wasbuffer (zie onderstaande lijst). Voor elke buffer, incubeer kralen in de buffer voor 10min op een overhead-schudder bij 4 ° C, dan draaien voor 2min op 440 xg, verwijder supernatant, en voeg de volgende buffer. Lage zout wasbuffer Hoog zoutgehalte wasbuffer LiCl wasbuffer TE wasbuffer Na de laatste wasbeurt, volledig te verwijderen alle resterende buffer. 4. De-verknoping van histonen en DNA, en zuivering van DNA neergeslagen Voeg 100μL van de-verknoping buffer naar de agarose pellet en de 40μl 'input' monster uit stap 3.4, mix voor 5min op een vortex-mixer, spin monsters, en incuBate bij 65 ° C gedurende de nacht. Zuiver DNA met een commerciële DNA-of PCR zuivering kit. Typisch 5μl van een 1:05 verdunning van de laatste kolom eluaat voldoende zijn om uit te voeren conventionele locus-specifieke real-time kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR). 5. Tabel van buffers Verknoping buffer Natriumbutyraat 10 mM Sucrose 400mm Tris-HCl, pH 8,0 10 mM β-mercapto-ethanol 5mM Formaldehyde 3% (v / v) Extractiebuffer # 1 Natriumbutyraat 10 mM Sucrose 400mm Tris-HCl, pH 8,0 10 mM β-mercapto-ethanol 5mM Compleet proteaseremmer 1x Extractiebuffer # 2 Natriumbutyraat 10 mM Sucrose 250mm Tris-HCl, pH 8,0 10 mM β-mercapto-ethanol 5mM MgCl 2 10 mM Triton X-100 1% (w / v) Compleet proteaseremmer 1x Extractiebuffer # 3 Natriumbutyraat 10 mM Sucrose 1.7M Tris-HCl, pH 8,0 10 mM β-mercapto-ethanol 5mM MgCl 2 2 mM Triton X-100 0,15% (w / v) Compleet proteaseremmer 1x Ultrasoonapparaat buffer Tris-HCl, pH 8,0 25MM EDTA-NaOH, pH 8,0 5mM SDS 0,5% (w / v) Compleet proteaseremmer 1x Antilichaambinding buffer Tris-HCl, pH 8,0 50 mM EDTA-NaOH, pH 8,0 1 mM NaCl 150mm Triton X-100 0,1% (w / v) Lage zout wasbuffer NaCl 150mm SDS 0,1% (w / v) Triton X-100 1% (w / v) EDTA-NaOH, pH 8,0 2 mM Tris-HCl, pH 8,0 20MM Hoog zoutgehalte wasbuffer NaCl 500mm SDS 0,1% (w / v) Triton X-100 1% (w / v) EDTA-NaOH, pH 8,0 2 mM Tris-HCl, pH 8,0 20MM LiCl wasbuffer Lithiumchloride 250mm Nonidet-P40 1% (v / v) Natrium desoxycholaat 1% (w / v) EDTA-NaOH, pH 8,0 1 mM Tris-HCl, pH 8,0 20MM TE wasbuffer EDTA-NaOH, pH 8,0 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM Decrosslinking buffer Tris-HCl, pH 6,8 62,5 mm NaCl 200MM SDS 2% (w / v) DTT 10 mM 6. Representatieve resultaten: Expressie van de Arabidopsis thaliana PR2 verdediging gen dat codeert voor een β-1,3-glucanase met antimicrobiële activiteit 12, werd geïnduceerd door benzothiadiazole (BTH), een synthetisch analoog van het plantenhormoon salicylzuur 3. Figuur 1 toont aan dat activatie van PR2 expressie geassocieerd is met een toename van de acetylering van lysine residuen op histon H3 en H4 op de PR2 promotor. Sinds nucleosoom dichtheid afneemt tijdens gen activatie 13, werden histonacetylering waarden genormaliseerd voor het signaal verkregen met een antilichaam tegen een invariant gebied van histon 3. Figuur 1 BTH induceert histonacetylering op de PR2 promotor in Arabidopsis. Planten werden behandeld met 100 urn BTH of een spuitpoeder controle. Na 72h, werden bladeren verzameld en chromatine werd geïsoleerd. Het signaal verkregen na precipitatie met acetylering-specifieke antilichamen (zoals aangegeven in de figuur) werd genormaliseerd om het signaal verkregen door precipitatie met een antilichaam tegen een invariant domein van histon H3. Neergeslagen chromatine werd gekwantificeerd door RT-qPCR. De gegevens zijn gestandaardiseerd voor histon-eiwitten niveaus in de afwezigheid van BTH behandeling.