الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات
Summary
يوصف منهج موثوق بها ومفيدة للكشف عن تعديلات بسيطة على الجينات النباتية محددة. نهج يجمع بين لونين مناعي (رقاقة) في الوقت الحقيقي وPCR الكمي. فإنه يسمح الكشف عن تعديلات بسيطة على جينات معينة لها دور في العمليات الفسيولوجية المختلفة.
Abstract
هيكل لونين من المهم لتنظيم التعبير الجيني في حقيقيات النوى. في هذه العملية ، إعادة عرض لونين ، الحامض النووي ، والتساهمية التعديلات على ذيول الأميني من محطة H3 H4 histones وتلعب أدوارا أساسية 1-2. H3 H4 وتشمل التعديلات هيستون مثيلة ليسين وأرجينين ، أستلة من ليسين ، والفسفرة مخلفات سيرين 1-2. وترتبط هذه التعديلات إما مع تنشيط الجينات ، والقمع ، أو دولة معبى من الجين الذي يعتمد التنشيط أكثر سرعة وقوة في التعبير بعد إدراك الإشارات المناسبة (ميكروب المرتبطة بأنماط الجزيئية ، والضوء ، والهرمونات ، وغيرها) 3-7.
هنا ، فإننا نقدم وسيلة للكشف عن موثوقة وحساسة من تعديلات محددة على لونين جينات النباتات المختارة. وتستند هذه التقنية على يشابك من (تعديل) والحمض النووي histones مع 8،9 الفورمالديهايد ، واستخراج وصوتنة من لونين ، لونين مناعي (رقاقة) مع الاجسام المضادة المحددة تعديل 9،10 ، دي يشابك المجمعات الدنا هيستون ، و جينات محددة في الوقت الحقيقي PCR الكمي. وقد أثبت هذا النهج مفيدا للكشف عن تعديلات بسيطة محددة مرتبطة C 4 الضوئي 5،11 في الذرة والحصانة الشاملة في 3 Arabidopsis.
Protocol
Discussion
أهم الخطوات في البروتوكول هي يشابك من الحمض النووي وhistones ، نوع وكمية المواد ورقة ، وطحن المواد ، وصوتنة من لونين. للاطلاع على مناقشة أكثر تفصيلا لهذه القضايا ، انظر الحكام. 9 و 10.
صوتنة ويشابك :
من المهم أن تعطيل لونين خلال صوتنة إلى شظايا من حوالي 400bp. سوف صوتنة تدمير شاملة لونين من خلال تعطيل الحمض النووي وhistones ، في حين سيغادر صوتنة كافية لونين شظايا طويلة. هذه تؤثر على خصوصية الأسلوب ، لأنه لا يمكن إدخال تعديلات بسيطة القاصية من موضع اختبار يكون هناك تمييز من التعديلات المحلية. يتم اختبار كفاءة صوتنة أفضل من خلال جمع عينات من لونين 20μL قبل وبعد صوتنة الحمض النووي دي يشابك ، وhistones وعزل الحمض النووي وتحديد طول الحمض النووي المنفصمة التي agarose هلام إستشراد. وينبغي أن يضاف إلى ريبونوكلياز عينات قبل الكهربائي ، لأن التحضير لونين لا يزال يحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي في هذه المرحلة من التنقية التي قد تتداخل مع التصور من الحمض النووي مجزأة. نماذج مفيدة للمناعي لونين إذا دنا من لونين غير المنفصمة أطول من 10kbp ، في حين أن الحمض النووي من لونين المنفصمة أشكال مسحة مع كثافة إشارة حول الأقصى 400bp من الحمض النووي.
نستخدم عادة 3 ٪ (V / V) الفورمالدهيد لونين يشابك في أوراق سليمة ، ولكن 1 ٪ (V / V) الفورمالدهيد قد يكون كافيا في معظم الحالات. في أيدينا ، وتركيزات منخفضة الفورمالديهايد تسمح لأوقات أقصر صوتنة الخلفية والإشارات في تفاعلات PCR يترتب على ذلك. ومع ذلك ، كميات كافية من الفورمالديهايد في كثير من الأحيان نتيجة للتكرار منخفضة للإشارة PCR بين التجارب المستقلة. هذا قد يكون راجعا إلى عدم كفاية اختراق يترك مع الفورمالدهايد بتركيزات منخفضة. تأكد من أن البورصة الخاص الفورمالديهايد كثيرا ما يميل إلى مجمع تتبلمر مع مرور الوقت. الفورمالديهايد حلول مستقرة فقط لمدة شهر واحد تقريبا ، وتكاد هذه الفترة لفترات طويلة قبل تحقيق الاستقرار الميثانول. ينصح لاختبار تركيزات مختلفة الفورمالديهايد عند إعداد الشروط التجريبية.
كمية من المواد النباتية وطحن :
من المهم أن التسلل كميات قليلة من المواد لأوراق الشجر في كمية كبيرة من أوراق عازلة لتجنب الالتصاق مع بعضها البعض. أوراق شائكة غالبا ما يؤدي إلى عدم كفاية تسلل الفورمالديهايد. وعلاوة على ذلك ، فإن الكثير من المواد النباتية كتلة مسام النسيج miracloth. كفاءة طحن تعتمد بشكل كبير على استخدام قذائف المورتر ومدقة مع مثاليا. نحن عادة طحن مع النيتروجين السائل تبرد مدقة وهاون في غياب النتروجين السائل إضافية ثلاث مرات لمدة 50 ثانية حتى يتم الارض المادية إلى مسحوق ناعم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الألمانية (DFG) ومبادرة التميز للحكومات الفيدرالية وحكومات الولايات الألمانية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Protein-A-Agarose | Roche | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11836145001 |
References
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
- Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
- Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
- Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
- Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
- Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
- Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
- Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
- Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
- Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
- Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
- Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).
