Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

1. Alvleesklierweefsel collectie in de operatiekamer De chirurg voert een gedeeltelijke resectie van de alvleesklier. Na het plaatsen van de alvleesklier model in een doos op ijs, direct afleveren bij de patholoog. 2. Weefsel selectie voor eilandje isolatie De patholoog kiest weefsel dat verschijnt zacht en gezond, met behoud van het beschadigde weefsel voor diagnostische doeleinden. Fibrotische weefsel en exemplaren met minder dan 2 g bruikbaar weefsel zijn uitgesloten van eilandje isolement. Dompel de pancreas weefsel in Euro Collins Solution en leveren op het ijs naar het laboratorium. 3. Isolatie van menselijke eilandjes Weeg de pancreas weefsel, dan plaats deze in een 10 cm schotel. Doe 150 ml RPMI media in een 500 ml kolf. In een kolf van 250 ml, de voorbereiding van de verteringsenzymen oplossing door het combineren van 130 ml RPMI-medium met 100 mg / ml DNase en 20 ml van 5mg/ml Liberase RI. Trek 10 ml van deze oplossing in een spuit aan de pancreas weefsel te injecteren. Injecteer de spijsverteringsenzym oplossing in de pancreas weefsel, met als doel homogeen opgerekt het. Als dit wordt voorkomen door fibrose, zal de spijsvertering waarschijnlijk mislukken. Vervolgens gehakt het weefsel in de ~ 4 mm 3 stuks op ijs. 4. Menselijke pancreas spijsvertering circuit Monteer de spijsvertering circuit zoals weergegeven in figuur 1. De stromingsrichting in de Ricordi kamer is aan de onderzijde en uit aan de bovenkant van de kamer. Voeg de resterende spijsverteringsenzym oplossing om de kolf van 500 ml tot een totaal volume van 300 ml en plaats een thermometer. Breng de pancreas weefsel in de kamer, steek de mesh (poriëndiameter: 600 pm) en drie Siliciumnitride Marbles (diameter: 15 mm), sluit de kamer en start de pomp met de stroom ingesteld op 140 ml / min. Wanneer de temperatuur van het circuit 37 ° C bereikt, start de timing en periodiek monsters om te bepalen wanneer de spijsvertering te stoppen te nemen. Kleuring met dithizone (2 mg / ml) kunnen microscopische visualisatie van eilandjes binnen de verteerd weefsel 4. Zodra de eilandjes worden gescheiden van het omringende weefsel acinaire, snel stoppen met de spijsvertering door het plaatsen van het verwarmingselement op het ijs en het toevoegen van 200 ml koud wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) naar het circuit. Verzamel het eilandje oplossing in 250 ml conische buizen zoals het komt uit de steekproef buis. Ga verder tot het circuit is leeg. Figuur 1. De menselijke pancreas spijsvertering circuit De menselijke pancreas spijsvertering circuit bestaat uit een Ricordi kamer met mesh (poriëndiameter: 600 pm) en drie siliciumnitride knikkers (diameter: 15 mm). Uitstroom uit de kamer is gedreven om het weefsel collectie kolf door de peristaltische pomp (140 ml / min). Pijlen geven de stroomrichting. Een optimale temperatuur voor enzymatische vertering wordt onderhouden door onderdompeling van de verwarmingsspiraal in een 37 ° C waterbad. 5. Wassen na-vergisting Centrifugeer de 250 ml conische buizen met daarin het eilandje oplossing bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, resuspendeer de eilandje pellet in wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) en distribueren in gelijke fracties aan 50 ml conische buizen. (Optioneel:. Verdeel in extra conische buizen te verbeteren wassen) Centrifugeer bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Gooi supernatant voorzichtig los pellets door handmatige schudden. 6. Zuivering op een Ficoll helling Resuspendeer de pellet met Ficoll media bij een dichtheid van 1,125 g / ml, pH 7,4 en langzaam 10 ml porties van Ficoll media overlay met een dichtheid van 1,080, 1,060 en 1,037 g / ml. Centrifugeer de Ficoll gradiënten bij 2400 rpm, 4 ° C gedurende 20 minuten. 7. Islet Verzamelen en Cultuur Na het centrifugeren, kunnen verschillende weefsel componenten worden onderscheiden door hun verdeling in het verloop. Gooi de bovenste laag bestaat uit vet en bindweefsel. Voorzichtig oogst van de eerste laag van het eilandje aggregaten bij de 1,037-1,060 g / ml interfase. Deze laag bevat de meest pure geïsoleerde eilandjes. Gescheiden in te zamelen fracties voor een efficiënte isolatie. Verzamel de tweede, minder zuivere fractie van eilandje aggregaten op de 1.060-1.080 g / ml interfase. Verdun de Ficoll gradiënt door de toevoeging van wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) aan elke conische buis tot een totaal volume van 50 ml. Centrifugeer bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant door afzuigen. Wees voorzichtig als de pellet zou kunnen verliezen als gevolg van de Ficoll verloop. Was de pellets wie wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) en gecentrifugeerd bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Herhaal dit met behulp van eilandje cultuur media Resuspendeer de eilandjes in cultuur media en plaats ze in de incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 24-48 uur voordat verdere verwerking.