Summary

Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination

Published: August 01, 2011
doi:

Summary

Ein<em> In vivo</em> Methode, um Genfunktionen in postnatalen Gehirn-Test beschrieben. Rekombinante AAV Ausdruck Cre und / oder ein fluoreszierendes Protein werden in neonatalen Gehirn der Maus injiziert. Mosaic Gen-Inaktivierung und spärliche neuronale Markierung erreicht, die eine schnelle Analyse der Genfunktion in kritischen Prozesse auf neuronale Schaltkreis Entwicklung.

Abstract

Normale Funktion des Gehirns beruht nicht nur auf der Embryonalentwicklung, wenn wichtige Nervenbahnen etabliert sind, sondern auch auf die postnatale Entwicklung bei neuronalen Schaltkreisen gereift und verfeinert. Fehlregulation in diesem Stadium können zu neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie 1,2 führen. Viele Gene sind in der pränatalen Gehirn untersucht und festgestellt, von entscheidender Bedeutung für viele Entwicklungsprozesse 3-5. Allerdings ist ihre Funktion in der postnatalen Gehirn weitgehend unbekannt, teils weil ihre Deletion in Mäusen führt oft zu Letalität bei Neugeborenen Entwicklung, teils weil ihre Forderung in der frühen Entwicklung behindert die postnatale Analyse. Um diese Hindernisse zu überwinden, sind floxed Allele dieser Gene derzeit in Mäusen 6 erzeugt. Wenn mit transgenen Allele, die ausdrückliche Cre-Rekombinase in bestimmten Zelltypen, bedingte Löschung erreicht werden, um Genfunktionen in der postnatalen Gehirn studieren können kombiniert werden. Allerdings erfordert diese Methode zusätzliche Allele und zusätzliche Zeit (3-6 Monate), um die Mäuse mit den entsprechenden Genotypen zu erzeugen, wodurch die Expansion der genetischen Analyse, um im großen Maßstab im Gehirn der Maus.

Hier zeigen wir einen komplementären Ansatz, dass viral-Ausdruck Cre verwendet, um diese floxed Allele schnell und systematisch zu untersuchen in der postnatalen Entwicklung des Gehirns. Durch Einspritzen von rekombinanten Adeno-assoziierte Viren (rAAVs) 7,8 Kodierung Cre in der neonatalen Gehirn, sind wir in der Lage, das Gen von Interesse in verschiedenen Regionen des Gehirns zu löschen. Durch die Steuerung der virale Titer und Koexpression ein fluoreszierendes Protein-Marker, können wir gleichzeitig zu erreichen Mosaik Gen-Inaktivierung und spärliche neuronale Kennzeichnung. Diese Methode umgeht die Forderung vieler Gene in der frühen Entwicklung, und erlaubt uns, ihre Zelle selbst eine autonome Funktion in vielen kritischen Prozesse in der postnatalen Entwicklung des Gehirns, einschließlich axonalen und dendritischen Wachstums-Studie, Verzweigungen und Fliesen, sowie Synapsenbildung und Raffinesse. Diese Methode wurde bereits erfolgreich in unserem eigenen Labor (unveröffentlichte Ergebnisse) und andere 8,9 verwendet, und kann auch auf andere Viren, wie Lentivirus 9, sowie die Expression von shRNA oder dominant aktive Proteine ​​10 verlängert werden. Darüber hinaus durch die Kombination dieser Technik mit der Elektrophysiologie sowie kürzlich entwickelten optischen Imaging-Tools 11, bietet diese Methode eine neue Strategie zu untersuchen, wie genetische Signalwege neuronalen Schaltkreis Entwicklung und Funktion in Mäusen und Ratten beeinflussen.

Protocol

1. Vorbereitung Viren zur Injektion rAAVs wurden von den empfohlenen kommerziellen Anbieter erworben, aber sie können auch in der eigenen Labor hergestellt werden (siehe Diskussion unten). Das Virus ist in der Regel bei einem Titer von ~ 1×10 12 Genom Kopien pro Milliliter (GC / ml) hergestellt und kann bei voller Titer verwendet werden, um eine große Anzahl von Zellen zu manipulieren. Alternativ können sie verdünnt, um das gewünschte Maß an spärliche Beschriftung zu erzeugen. Die entspreche…

Discussion

Das Neugeborenen-viralen Injektion hier vorgestellte Methode bietet einen einfachen und schnellen Weg, um in vivo Mosaiken für das Studium der postnatalen Entwicklung des Gehirns zu erzeugen. Die Methode nutzt floxed Allele, die derzeit verfügbar sind sowie diejenigen, die über den High-Throughput-Gene Targeting Projekt 6 vorgenommen werden. Verglichen mit dem Einsatz von transgenen Expression von Cre, bietet diese Methode einen schnellen Weg, um Genfunktionen in verschiedenen Zelltypen Test, wie …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss von RO1 NIH (NINDS) unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, Vector Biolabs #7060, #7061, custom order http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pump 11 Plus Harvard Apparatus #702208 (No foot pedal port)
Retinal Pigment Epithelium Injection Kit World Precision Instruments RPE-KIT Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder
NanoFil Syringe, 100μl World Precision Instruments NANOFIL-100 Includes reusable loading needle
D-PBS Invitrogen 14040-117  
GFP antibody Aves GFP-1020  
DsRed antibody Clontech 632496  
Heating Block VWR 97042-610  
ROSA26R mouse Jackson Laboratory 003309  

References

  1. Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
  2. Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
  3. Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  4. Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  5. Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
  6. Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
  7. Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
  8. Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. 신경과학. 138, 501-510 (2006).
  9. Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
  10. Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
  11. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
  12. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
  13. Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
  14. Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).

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Cite This Article
Gibson, D. A., Ma, L. Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination. J. Vis. Exp. (54), e2823, doi:10.3791/2823 (2011).

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