Visualização das células intersticiais de Cajal Network (ICC) em ratos

1. Dissecção do mouse trato GI Camundongos submetidos à eutanásia por locais diretrizes IUCAC Pin cada membro na superfície de isopor e enxaguar superfície abdominal com etanol 70%. Abra cavidade abdominal com incisão mediana longo do diafragma para púbis. Fazer um corte no esôfago distal e um segundo corte no intestino distal grande e remover o trato GI do estômago ao ânus em bloco, corte cuidadosamente ligamentos no duodeno e ceco com uma tesoura pequena. Trato GI lugar numa placa de Petri com PBS. Dissecar longe mesentério usando uma pinça (Figura 1). Para separar o estômago, intestino delgado e intestino grosso, cortado em piloro e junção ileocecal. Lavar o lúmen de cada parte do trato GI com PBS usando uma seringa de 5ml preso a uma agulha de alimentação (ratos mais velhos) ou agulha sem corte (ratos mais jovens). Estômago aberto, intestino delgado, intestino grosso e ao longo da borda mesentérica. Corte dois pedaços para cada parte do trato gastrointestinal, um para visualização montar todo e um para cryosection. 2. Preparação da amostra toda montagem e imunomarcação Coloque a peça inteira de cada parte do trato gastrointestinal em um tubo de microcentrífuga 1,5 centímetros cheia com 1,0 ml de acetona gelada e amostras de correção para pelo menos 1 hora a 4 ° C. Amostras podem ser armazenadas por até uma semana a -20 ° C. Nós normalmente armazenam amostras em acetona e prossiga para preparar cyrosections. Lave 2X amostra com PBS. Colocar a amostra em placa de Petri com PBS. Sob dissecar miscroscope, cuidadosamente raspar camada mucosa com um bisturi, segurando uma ponta com um par de pinças, deixando a muscularis. Muscular pode ser cortado em pedaços de 5 mm para coloração com anticorpos diferentes. Não armazenar por mais de dois dias em PBS antes da coloração. Passos de bloco e de incubação pode ser feito em um poço de uma placa de 24 poços ou em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Bloco com 0,5 ml de tampão de bloqueio (soro de cabra 5%, 0,1% Triton X-100 em PBS por 1 hora a 4 ° C). Incubar com anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e rodar durante a noite a 4 ° C. Temos utilizado com sucesso ACK-2 rato anti-Kit, coelho anti-Ano1, e de coelho anti-Pgp9.5 anticorpos para a imunocoloração montar todo. Lavar por 5 min 2X com PBS em rotator em temperatura ambiente. Incubar com anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas a temperatura ambiente em rotador. Normalmente usamos Alexa Fluor 488 anti-coelho e Alexa Fluor 594 anti-rato anticorpos. Lavar por 15 min 3X com PBS em rotator em temperatura ambiente. Montagem no slide, lado seroso em cima para garantir a orientação do tecido durante a microscopia. Esta orientação irá garantir o lado seroso para enfrentar a lamela e ser encontrado primeiro como uma foca no slide em um microscópio. Fazemos isso em um microscópio de dissecação. Às vezes, examinaremos brevemente o tecido sob microscopia de fluorescência para orientar corretamente. Sob microscopia de fluorescência para visualizar Kit ou Ano1, deve-se encontrar o ICC-MY primeira rede do lado da lamela. Em seguida, aspirar PBS, tanto quanto possível, sem secar completamente. Adicionar 50 ul de media set difícil de montagem (usamos Prolong Gold) e coloque delicadamente lamínula em cima do tecido. Permitir configuração de montagem durante a noite a temperatura ambiente e slides armazenar a -80 ° C. Para exame microscópico, foi utilizado um microscópio de campo amplo com um Z-drive. Usamos tanto o objectivo de ar 20X (NA 0,75, Apochromat plano) ou objetivo do petróleo 60X (NA 1.4, Apochromat plano) e tomou 2 m ou 1 mícron Z-seções que abrangem a muscularis inteiro. As imagens foram posteriormente deconvoluídos usando software deconvolução Autoquant. Alternativamente, muitos outros usaram microscopia confocal vez com resultados semelhantes. 3. Preparação Cryosection e imunomarcação Coloque cada parte do trato GI, lado seroso baixo, flat em papel de filtro. Corte de papel de filtro em todo o tecido. Coloque o tecido em papel de filtro em paraformaldeído 4% (PFA) em PBS (nós diluir paraformaldeído 32% em frasco lacrado em PBS direito antes do uso) por 2 horas em temperatura ambiente. Fixação pode ser feito em um 6 – ou 12 bem-placa, dependendo do tamanho do tecido, ou em um microtubo de 1,5 ml. Se feito em chapa, parafilme para minimizar a exposição PFA. Vezes mais tempo de fixação pode resultar em mascaramento de antígenos, particularmente para o ACK-2 anticorpo anti-Kit. Remover o tecido da PFA e coloque em sacarose 30% em PBS. Permitir que o tecido a afundar durante a noite em 4 ° C. Equilibrar tecido com relação 1:1 de sacarose 30% e outubro por 1 hora. Então monte de tecidos verticalmente em cryomold cheia de outubro O eixo longitudinal do trato GI deve ser em paralelo com o cyrosections. Ao examinar os ratos com diferentes genótipos ou com diferentes tratamentos, pode ser útil para a montagem de tecido de ratos em diferentes cryomold mesmo para assegurar o processamento paralelo. Congelamento de gelo seco e colocar em freezer -80 ° C para armazenamento. Corte de 10 mM criosecçõesem slide e armazenar a -80 ° C freezer. Nós normalmente cortadas por duas seções de slides. Também costumam fazer H & E de coloração de uma lâmina cryosection. Para imunofluorescência, primeiro deslize equilibrar à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, desenhar círculo em torno do tecido usando caneta PAP. Bloco com 150 mL de tampão de bloqueio (o mesmo que para a imunocoloração montar todo) por 1 hora. Aspirar tampão de bloqueio e adicionar 150 mL de anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C em câmara úmida. Lavar 5 min 2x com PBS. Incubar com anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente. Normalmente usamos Alexa 488 anti-coelho e Alexa 594 anti-rato anticorpos. Lavar por 15 min 3X com PBS. Aspirar slide sem secagem total do tecido. Adicionar uma gota de set difícil de montagem de mídia com DAPI (usamos Prolong Gold) e coloque # 1.5 lamela. Slides lugar à temperatura ambiente durante a noite para definir e armazenar em freezer -80 C °. Adquirir triple imagens de fluorescência usando DAPI, FITC, e define Texas Red filtro. 4. Resultados representativos: Aqui, usamos o intestino grosso como um exemplo. H & E mancha de sacarose protegida fixa de congelação utilizado para imunofluorescência mostra alguns artefatos em comparação com uma seção de parafina de referência (Figura 2), onde a linha amarela demarks do plexo mioentérico entre as camadas musculares circular e longitudinal ea demarks linha verde na fronteira entre o mucosa e muscularlis. Examinando o cryosection, a partir da serosa a mucosa, você primeiro encontro da mais fina camada muscular longitudinal (LM), seguido do circular camada mais espessa do músculo (CM). A seção deve ser em paralelo com o músculo longitudinal para os núcleos de LM deve ser um pouco alongados, enquanto os núcleos do CM deve ser pequeno e redondo. Entre o LM e CM são plexi mioentéricos feito de neurônios que mancha com Pgp9.5. Pgp9.5 também processa manchas neuronal durante todo o CM. A rede mioentéricos ICC (ICC-MY) cercam o plexo mientérico e são feitos de células multipolar. Dentro da camada muscular longitudinal, há ICCs rara intramuscular (ICC-IMs), que são células bipolares operando em paralelo com o músculo. Dentro da camada muscular circular, existem abundantes ICC-IMs que também são células bipolares que correm paralelas com o músculo circular e são seccionadas transversalmente com este corte. Na junção dos muscularis e submucosa, a rede composta por submucosa ICC ICC-SMPs é uma rede fixa de ICCs multipolar. Examinando o Kit montar toda imunocoloração do intestino grosso, deve-se esperar encontrar o ICC-MY primeira rede, e então o ICC-IM do CM, e ICC-SMP redes, como uma foca da lamela (Figura. 3) . Medida volumétrica de redes ICC usando reconstrução 3D de toda montagem de imagens têm sido descritas 10. Usando wide-campo do microscópio, há fluorescência fora do plano significativa nas imagens-primas que podem ser removidos após a deconvolução (Figura 3). Incompleta stripping de mucosa irá resultar em alta fluorescência de fundo. ANO1 é outro marcador da ICC e co imunocoloração de KIT e ANO1 mostra sobreposição completa de ICC coloração (Figura 4). Representante figura 1. Dissecados do trato gastrointestinal do rato, reimpresso com permissão 13. Figura 2. A) Representante H & E coloração do intestino do rato grande de criosecções preparado como descrito e parafina referência incorporados secção que mostra alguns artefatos encolhimento de criosecções. O demarks linha amarela do plexo mioentérico ea linha azul separa a mucosa da muscularis. B) Representante Kit (vermelho, ACK-2) e Pgp9.5 (verde) imunofluorescência dupla com DAPI contracoloração (azul) do intestino de rato grande. LM: CM muscular longitudinal: músculo circular. Barra de escala 20 mM. Figura 3. Representante Kit (vermelho, ACK-2) imunofluorescência toda montagem do mesmo campo em três planos focais, o ICC-MY avião na fronteira LM / CM, o avião ICC-IM na CM, e-ICC SMP avião na fronteira CM / submucosa. Imagens brutas e imagens deconvoluídos são mostrados. Barra de escala 20 mM. Figura 4. Representante dupla imunofluorescência de Ano1 (verde) e Kit (vermelho, ACK-2) no intestino grosso. Barra de escala 20 mM.