والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية
Summary
ووصف نهج قوي لمراقبة تسليم العضيات لمعة الحامضية للفجوة الخميرة للتحلل وإعادة التدوير. الأسلوب يعتمد على وضع العلامات المحددة الهدف العضيات مع مضان المزدوجة الانبعاثات المرمزة وراثيا الحموضة ، جهاز الاستشعار البيولوجي ، والتصور من الخلايا الفردية باستخدام المجهر مضان.
Abstract
الالتهام الذاتي المهم للدوران من المكونات الخلوية في ظل مجموعة من الظروف المختلفة. أنها تخدم وظيفة أساسية استتبابي فضلا عن آلية لمراقبة الجودة التي يمكن أن تستهدف بشكل انتقائي وتتحلل المادة الخلوية بما في ذلك 4 – organelles1. على سبيل المثال ، تضررت أو زائدة الميتوكوندريا (الشكل 1) ، وليس التخلص منها عن طريق الالتهام الذاتي يمكن أن تمثل تهديدا للتوازن الخلوية وبقاء الخلية. في الخميرة ، خميرة يمكن السكيراء ، والحرمان من المواد الغذائية (مثل المجاعة النيتروجين) أو الضرر تعزيز دوران الانتقائي للالميتوكوندريا التي الالتهام الذاتي في عملية تسمى mitophagy 5-9.
وصفنا بسيطة نهج المجهري مضان لتقييم الالتهام الذاتي. من أجل الوضوح ونحن لدينا وصف تقييد هنا لاظهار كيف يمكن استخدام نهج لرصد mitophagy في خلايا الخميرة. ويجعل من استخدام مقايسة مراسل الفلورسنت ، روزيلا ، وهو جهاز الاستشعار البيولوجي المزدوجة الانبعاثات يضم الحموضة مستقرة نسبيا بروتين فلوري الأحمر مرتبطة بروتين درجة الحموضة حساسة الفلورية الخضراء. تشغيل هذا المراسل تعتمد على الاختلافات في درجة الحموضة بين (5،0-5،5 درجة الحموضة ~) فجوة والميتوكوندريا (درجة الحموضة ~ 8.2) في الخلايا الحية. تحت ظروف النمو ، وخلايا النوع البري يحمل كل مضان أحمر وأخضر وزعت في طريقة مميزة في الميتوكوندريا. لا يرتبط مضان الانبعاثات مع فجوة. عندما تتعرض لمجاعة النيتروجين ، وهو الشرط الذي يدفع mitophagy ، بالإضافة إلى مضان أحمر وأخضر وصفها الميتوكوندريا ، والخلايا يحمل تراكم الحمراء ، ولكن لا مضان أخضر ، في التجويف وفجوي الحمضية يمثل تسليم الميتوكوندريا إلى فجوة. احرز مع الخلايا الحمراء ، ولكن يمكن استخدام الفجوات الفلورية الخضراء لا كمقياس للنشاط في الخلايا mitophagic 5،10-12.
Protocol
Discussion
في الصور المعروضة في شكل تمثيلية. ويمكن 2B 2C يمكن ان ينظر اليها بشكل واضح أن استخدام عضية محددة للصحفيين الفلورسنت ومضان المجهري توفر أدلة على توطين الميتوكوندريا / التوزيع في كل من النمو والخلايا النيتروجين المتعطشة ، ويسمح mitophagy أن تصور.
فمن ينبغي التأكيد على أن لا يقتصر هذا الأسلوب لmitophagy التالية. يمكن رصد الالتهام الذاتي من المكونات الخلوية الأخرى أو العضيات (على سبيل المثال ، ريبوسوم ، قطرات الدهون ، peroxisomes ، شبكية هيولي باطني والنواة) مع وضع العلامات المناسبة. وقد ذكرت تفاصيل عن بناء جهاز الاستشعار البيولوجي روزيلا ، والظروف والنتائج خلية ثقافة نموذجية لدوران النواة (nucleophagy) 11،12 توضح التوسع في تطبيق الأسلوب.
استخدام عضية محددة للصحفيين الفلورسنت لرصد الالتهام الذاتي يتطلب أن تبقى عدة اعتبارات تصميم بناء في الاعتبار. وهذه تشمل : (1) اختيار والانصهار في إشارة إلى مناسبة تستهدف تحقيق عضية محددة الاستهداف ؛ (2) اختيار البروتين الفلوري المناسبة (ق) ، (3) الانبعاثات مضان قوية ؛ (4) توطين عضية الصحيح و / أو التوزيع داخل الخلية. بمجرد مراسل عضية محددة أعرب بنجاح في استضافة الخميرة اختيار سلالة المجموعة الثانية من الاعتبارات يصبح : (1) ظروف نمو الخميرة ، (2) إعداد نموذج الخلية ؛ (3) معلمات التصوير كما أنه من المهم أن المعلمات المختارة لCLSM (على سبيل المثال ، وكثافة الليزر ، وفحص معدل واسطة ، قيمة ذات الثقب ، وقيمة التكبير وأهدافها المستخدمة أو التعرض للكاميرا CCD) تمسك طوال تجربة ضمان إمكانية إجراء مقارنات بين السيطرة (خلايا النمو) وعينات جوعا ؛ ( 3) الحث الالتهام الذاتي وناجحة تسليم الصحفي إلى فجوة.
عموما ، هذا الأسلوب المجهري الفلورسنت سهلة وسريعة نسبيا ، والتطبيق المحتمل لفحص إنتاجية عالية على المخدرات الرواية التي تعزز أو تعيق الالتهام الذاتي ، وأيضا عن الجينات التي تنظم أو تعدل الالتهام الذاتي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق البحث الاسترالي غرانت DP0986937 المجلس.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae EasyComp Transformation Kit | Invitrogen | K5050-01 |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | BD Difco | 200-0030 |
| Low melting agarose | Progen Biosciences | 200-0030 |
| Microscope slides (76 x 26 mm) | Menzel-Gläser | |
| Microscope coverslips (22 x 22 mm) | Menzel-Gläser | BB022022A1 |
| Confocal Laser Scanning Microscope Fluoview FV500 | Olympus | |
| CMAC-Arg | Moleular Probes-Invitrogen | Y-7531 |
All concentrations given are w/v, unless otherwise indicated.
Yeast minimal medium (YMM): 0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 2% glucose, 1.5% agar (only added when making solid media) and any required auxotrophic supplements (0.01%)].
Saccharomyces Salts (SS): (NH4)2S04, 0.12%; KH2PO4, 0.10%; MgC12.6H2O, 0.07%; NaC1, 0.05%; CaCl2, 0.01%; FeC13, 0.0005%.
Growth medium: SS and 2% ethanol (v/v) and appropriate auxotrophic supplements.
Nitrogen-starvation medium: 0.17% yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate (Difco), 2% ethanol (v/v).
References
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40, 280-293 (2010).
- Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. Monitoring mitophagy in yeast. Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).
- Yen, W. L., Klionsky, D. J. How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging. Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).
- Tolkovsky, A. M. Mitophagy. Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).
- Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. Mitophagy in yeast: actors and physiological roles. FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).
- Kanki, T., Klionsky, D. J. The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast. Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).
- Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy. Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).
- Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags. Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, 205-213 (2008).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
