遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出
Summary
このビデオでは、ホルマリン固定パラフィン包埋材料からのDNA抽出のためのプロトコルを示しています。これは、組織切片をキシレンで脱パラフィンされている複数の日手続き、エタノールで再水和とその後の遺伝子特異的またはゲノムワイドな解析のためにDNAを精製し、分離するプロテイナーゼKで処理です。
Abstract
病気の発生と進行は染色体再配列、コピー数の損益およびDNAメチル化を含む頻繁な遺伝とエピジェネティックな異常によって特徴付けられる。マイクロアレイのような高スループット、ゲノムワイドなプロファイリング技術、、の進歩は著しく、これらの特定の変化を識別して検出するために我々の能力を改善している。技術が向上し続けているしかし、制限要因は、サンプルの品質と可用性のまま。また、フォローアップ臨床情報と疾患の転帰は、しばしば数年、最初の検体採取後に収集されます。検体は、通常、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）、数十年の年間入院アーカイブに格納されています。抽出の適切な方法が適用されている場合、DNAが効率的かつ効果的にパラフィン包埋標本から回収することができます。適切に維持され、保存された検体から抽出した高品質のDNAは正常と病変組織との遺伝的およびエピジェネティックな署名の生成1の比較のために定量的なアッセイをサポートすることができます。パラフィン包埋サンプル、組織のコアやマイクロダイセクション組織からDNAを抽出するために組織からパラフィンを溶解するキシレン処理に供してから、エタノールの一連の洗浄を使用して再水和されています。タンパク質やヌクレアーゼなどの有害な酵素は、その後、プロテイナーゼK、などのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のような変性剤を含む消化2を容易に溶解バッファーの添加によって消化されています。核酸は、二相溶液を生成するバッファー飽和フェノールと高速の遠心分離を用いて組織ライセートから精製されています。タンパク質、脂質、多糖類の間と有機相のそれぞれに隔離されている間にDNAとRNAは、上部の水相に残る。水相と繰り返しフェノール抽出の保持は、きれいなサンプルが生成されます。フェノール抽出に続いて、RNアーゼAは、汚染RNAを除去するために追加されます。追加のフェノール抽出は、RNaseのインキュベーション後の、残りの酵素を除去するために使用されています。酢酸ナトリウムとイソプロパノール沈殿DNA、および高速の遠心分離の加算は、ペレットにDNAを使用し、イソプロパノール除去を促進しています。過剰な塩は、再ペレットに遠心分離によってDNA 3続いて、その後の酵素アッセイに干渉することができますが、70％エタノールで洗浄することによりDNAから除去することができる沈殿から引き継が。 DNAは、蒸留水または任意の緩衝液に再懸濁し、定量化し、-20℃で保存されています精製したDNAが続いて含まれて下流のアプリケーションで使用できる、限定されるものではないが、PCR、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション4（アレイCGH）、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）と組織/腫瘍サンプルの統合的な解析を可能にする、シークエンシング。
Protocol
Discussion
病理組織学的解析と診断のための生検または外科的に切除した組織は、長期保管のために頻繁にホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）です。疾患の遺伝的基礎を理解する上で関心の高まりとともに、これらのサンプルからDNAを抽出する能力は、ゲノム解析とトランスレーショナル研究のために使用できる診断材料の貴重なソースを表します。歴史的にFFPEサンプルは、核酸などの分子解析のための実行可能なソースと見なされていなかった大きくタンパク質-核酸と6をつなぐタンパク質間クロスによって変更される可能性があります。しかし、プロテアーゼ消化は、PCR、アレイCGH、シーケンシングおよびメチル化のプロファイリングを含むダウンストリームの解析に適している断片化核酸を放出することの発見は、遺伝学的解析6のこれらの貴重な標本を使用できるようになります。
パラフィン包埋組織からのDNA抽出は、DNAを精製するため、差動溶解性に依存している堅牢な手順です。抽出したDNAの質と量とそれに続くDNA増幅の成功は、抽出作業中および作業後は、パラメータの数に依存しています。これらは、これらに限定されない：組織の種類と量、組織保存のために使用される固定液の種類、に固定、パラフィンブロックと保管条件の年齢だけでなく、所望のDNAセグメントの長さの期間を1,7を増幅。未溶解パラフィンが悪いサンプルの品質とPCR増幅の阻害につながるとして、組織からのパラフィンの除去は、抽出成功のための最も重要なステップです。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、彼らの評価とこのビデオと記事の批判のためにラムの研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作業は、保健研究のためのカナダの協会からの資金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
