Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d'organes en Intact Drosophile Les chrysalides

<p class="jove_content"<strong> Matériel requis:</strongDissection> stéréomicroscope, ruban adhésif double face, lame de microscope standard et lamelle, pinces à dissection (taille 5 ou 5.5), soft-brosse à poils, de graisse de silicone sous vide, une seringue 5cc, papier Whatman, confocale ou microscope à épifluorescence avec appareil photo numérique et de l'image logiciel d'acquisition.</p><p class="jove_title"> 1. Dissection pupes</p><ol><li> Mettre en place une croix (en utilisant la combinaison appropriée de Gal4 ligne et une protéine de fusion GFP marqués sous le contrôle UAS) ou mouches lieu d'un stock d'images que vous souhaitez dans plusieurs flacons frais à 25 ° C.</li><li> Cellules SOP général commencent à proliférer sur le thorax nymphe moins dix-huit heures après le début de la nymphose, nous avons donc sélectionnez "blanc" pupes dans le stock approprié ou volée croisée. Blanc nymphes ont la morphologie pupe, mais ont un cas non pigmentée pupe, indiquant que ce sont pupariated dans l'heure.</li><li> Attendez environ 18 heures.</li><li> Placer un morceau de ruban adhésif double face sur la lame. Recueillir les pupes et adhèrent le cas nymphe au ruban double-face avec la face ventrale vers le bas. Saisir le bord de l'opercule (la trappe circulaire sur l'extrémité antérieure dorsale de la coque de nymphose) avec la pince</li><li> Soulevez doucement, retirez et jetez l'opercule, révélant la tête de la mouche immatures.</li><li> Utilisez la pince pour commencer à déchirer le long du côté de l'affaire chrysalide. Soulevez la section médiane de la coque de nymphose du côté déchiré et l'amener sur le côté opposé, soit le supprimer complètement ou le joindre à la bande, révélant le thorax et la partie antérieure de l'abdomen. (<strong> Note</strong>: Il ya un écart entre la volée en développement et la coque de nymphose. Soyez prudent de ne pas percer la volée comme le mur de l'affaire est déchiré.)</li><li> Commencez à couper le long du même côté de la coque de nymphose vers l'extrémité postérieure. Encore une fois, faites attention à ne pas percer la volée. Tirez sur la coque de nymphose de l'autre côté de la mouche et appuyez sur le ruban adhésif double face. L'abdomen devrait maintenant être complètement dégagées. Placez la brosse à soies souples directement sous la tête de la mouche. Une fois que la mouche est collé à la brosse et libre de la coque de nymphose, utilisez la brosse pour soulever doucement la volée de la lame.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Nymphe de montage</p><p class="jove_content"> Après dissection, les nymphes sont ensuite montés entre lame et lamelle:</p><ol start="8"><lipupes> D'isolement retiré de cas peut alors être placé sur le centre d'une face dorsale lame de verre en place.</li><li> Faire un cadre carré de papier Whatman 18x18mm en laissant une ouverture de 10×10 mm dans le milieu. Plonger dans l'eau du papier jusqu'à saturation. Placez autour de la chrysalide.</li><li> Utiliser une seringue de 5 cc remplie de graisse à vide en silicone, appliquer une couche uniforme de graisse autour du cadre Whatman. La couche de graisse doit s'inscrire dans la lamelle (figure 1) et l'épaisseur doit être seulement un peu plus grand que le diamètre chrysalide.</li><li> Placer une petite goutte d'eau (1 pi) au centre d'une lamelle mm 22×22 et placer la lamelle sur la préparation ci-dessus tels que les contacts de petites gouttelettes d'eau de la surface que vous voulez à l'image, notum dans ce cas). Compresser doucement pour former une étanchéité totale de graisse à vide et la surface plane de contact entre la lamelle et la cuticule chrysalide.</li><li> Prep peut alors être imagé sur microcopes inversé ou debout, en utilisant soit epifluorecence, confocal (balayage laser ou la filature type de disque) ou à deux photons confocale. Si vous êtes prudent, les mouches adultes peuvent être récupérées après plusieurs jours.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Les résultats représentatifs:</p><p class="jove_content"> Utilisation d'une ligne spécifique SOP-Gal4 (<em> Neuralized</em>-Gal4) a traversé les protéines GFP marqués à l'étiquette du fuseau mitotique (tubuline ou Tau-GFP) ou des protéines histones (H2B-GFP), on peut observer plan de division de la division cellulaire SOP, la longueur du cycle cellulaire, ou du nombre de mitoses divisions en utilisant laps de temps d'imagerie⁹. Autres protéines de fusion qui ciblent organites cellulaires tels que Rab-GTPases pour marquer les différents compartiments de l'endocytose (Rab5-GFP pour endosomes précoces ou de Rab11 GFP pour le recyclage des endosomes) ou des protéines importantes dans la régulation de signalisation Notch (Numb-, Partenaire de Numb-GFP, ou Sanpodo -GFP) peut apporter un éclairage important sur les mécanismes de division cellulaire asymétrique et le trafic des protéines membranaires^2,3,7,10,11.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figure 1: dissection de nymphe et de montage. A.</strong> Etape par étape, les images montrent la procédure pour retirer la coque de nymphose et préparer les pupes intacte pour l'imagerie cellulaire de montage et de vivre. Pupes sont retirés du flacon et placé, côté dorsal haut, sur adhésif double attaché à une lame de verre. La première colonne, l'enlèvement de l'opercule et à la déchirure le long du côté de la coque de nymphose. Deuxième colonne, l'enlèvement de coque de nymphose de la région thoracique et abdominale. La nymphe libre est alors soulevé par le cas en utilisant une nymphe brosse à poils doux.<strong> B.</strong> Montage pupes entre lame et lamelle. Pupa est placé dorsale vers le haut sur la lame de verre, entouré par un cadre de papier Whatman imbibé. Un cordon continu de graisse à vide en silicone extrudé à partir d'un seringue 5cc fonctions pour sceller la combinaison glisser-lamelle, la protection de la nymphe de la dessication et l'élévation de la lamelle afin qu'il se repose doucement sur le thorax chrysalide. Une petite goutte d'eau (1 pi) à l'interface entre la lamelle et la cuticule du thorax améliore la qualité d'image nettement lors de l'utilisation des objectifs à immersion (eau ou huile).<a href="http://www.jove.com/kr/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg/"> Cliquez ici pour agrandir l'image</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figure 2: des images représentant des cellules différenciées SOP vivre et externes des organes sensoriels prises utilisant notre dissection de nymphe et de montage procédure. Une</strong>. Images extraites d'une série temporelle d'une cellule SOP mitotique exprimant la protéine de fusion GFP-actine sous le contrôle de<em> Neuralized-</em> Gal4 (<em> Neur-</em> Gal4/UAS-actin-GFP), note l'accumulation de l'actine corticale au sillon (1 image / toutes les 2 minutes).<strong> B</strong>. Cellules filles SOP co-exprimant Partenaire de Numb-DP (rouge) et Rab5-GFP conduit par<em> Neuralized-</em> Gal4, notez la distribution asymétrique des Pon-DP dans une cellule fille (pIIb) et la distribution de endosomes précoces dans les deux cellules filles.<strong> C</strong>. Rendu de volume d'une série Z des prises différenciés des organes sensoriels externes à un stade tardif chrysalide. Structures cuticules, comme mechnosensory soies et poils épidermiques sont révélées par la cuticule autofluorescence (rouge). De plus, nous avons utilisé le système pour exprimer MARCM Lgl-GFP (pilotée par<em> Neuralized-</em> Gal4) dans un sous-ensemble de cellules sensorielles précurseur de l'organe (en vert). (Ces images ont toutes été acquises en utilisant un C1 Nikon microscope confocal à balayage utilisant un objectif de 60X 1,45 NA)</p>