ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d'ADN pour la grippe
Summary
technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est présentée comme une alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence pour les microarrays. Basé sur la photopolymérisation, ampliPHOX produit des taches polymère solide visible à l'œil nu dans quelques minutes. Les résultats sont ensuite imagé et automatiquement interprété avec un logiciel simple mais puissant.
Abstract
Puces à ADN sont apparues comme un puissant outil de détection des agents pathogènes. 1-5, par exemple, de nombreux exemples de la capacité de type et de sous-type du virus grippal ont été démontrés. 6-11 L'identification et le typage de la grippe sur les puces à ADN a des applications dans les deux publics la santé et de la clinique pour la détection précoce, d'intervention rapide, et en minimisant l'impact d'une pandémie de grippe. Fluorescence traditionnelle est actuellement la méthode la plus couramment utilisée puces de détection. Cependant, comme la technologie des biopuces progresse vers une utilisation clinique, une instrumentation coûteuse remplacer à faible coût de la technologie de détection présentant des caractéristiques de performance similaire à la fluorescence fera des essais biopuces plus attractif et rentable.
La technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est destiné aux applications de recherche, et a une limite de détection au sein d'un ordre de grandeur de la fluorescence traditionnelle 11, avec un avantage principal étant une approximative de dix fois moindre coût instrument par rapport aux scanners biopuces à fluorescence confocale requis pour biopuces détection. Un autre avantage est la taille compacte de l'instrument qui permet pour la portabilité et la flexibilité, à la différence des instruments traditionnels de fluorescence. Parce que la technologie de polymérisation n'est pas comme intrinsèquement linéaire comme la détection par fluorescence, cependant, il est le mieux adapté à la densité plus faible applications des biopuces dans lequel une réponse oui / non de la présence d'une certaine séquence est souhaitée, comme pour les tableaux de détection de pathogènes. Actuellement, la densité maximale du spot compatible avec la détection ampliPHOX est ~ 1800 spots / tableau. En raison des limites de densité au comptant, biopuces haute densité ne sont pas adaptés pour la détection ampliPHOX.
Ici, nous présentons la technologie ampliPHOX détection colorimétrique comme une méthode d'amplification du signal sur une puce à faible densité développé pour la détection et la caractérisation des virus de la grippe (FluChip). Bien que ce protocole utilise le FluChip (une puce à ADN) comme une application spécifique de ampliPHOX détection, aucune puce incorporant cibles biotinylées peuvent être étiquetés et détectée d'une manière semblable. La conception de microréseau et biotinylation de la cible pour être capturés sont de la responsabilité de l'utilisateur. Une fois la cible biotinylé a été capturé sur le tableau, la détection ampliPHOX peut être effectuée par le marquage d'abord le tableau avec un conjugué streptavidine-étiquette (ampliTAG). Après exposition à la lumière en utilisant l'instrument de ampliPHOX Reader, la polymérisation d'une solution de monomère (ampliPHY) ne se produit que dans des régions contenant ampliTAG marqué cibles. Le polymère formé peut être ensuite colorées avec une solution non toxique pour améliorer le contraste visuel, suivi par imagerie et d'analyse en utilisant un logiciel simple (ampliVIEW). Le dosage de FluChip entière de l'ONU-échantillon extrait d'entraîner peut être effectuée en environ 6 heures, et les mesures de détection ampliPHOX décrit ci-dessus peut être complété en environ 30 min.
Protocol
Discussion
La technologie de détection colorimétrique ampliPHOX présenté ici est un rapide, alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence seule couleur pour les applications des biopuces baisse de densité. Schématisé à la figure 1, le principe de détection est basée sur l'utilisation d'un label de photoamorceur (1B). En présence d'une solution contenant du monomère (1C), exposition à la lumière des causes du photoamorceur (ampliTAG) pour déclencher une réaction de polymér…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR reconnaît NIH / NIAID U01AI070276 et R43AI077112 du financement de ce travail.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
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