Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier l'efficacité d'induction cardiogénique

1. Corps embryonnaire (EB) en utilisant la formation de base 96-rondes et des plaques de microtitration Cultiver des cellules ES de souris dans des assiettes de 10 cm de culture de cellules de souris avec des moyennes de cellules ES complétée par FRV. Lorsque les cellules ES sont prêts à l'emploi (généralement à 50-70% de confluence), retirer le support ES et rincer les cellules une fois avec 5ml de PBS stérile. Ajouter 2ml 0,05% de trypsine / EDTA à chaque plaque et incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 ~ 5 minutes, la trypsine EDTA Quench avec 3 supports ES ml. Transfert aux cellules de tubes Falcon 50 ml et centrifuger à 1000 rpm pendant 3 minutes. Retirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec la quantité désirée de EB médias. Comptez le nombre de cellules et de diluer les cellules à 5 x10 3 cellules / ml dans EB médias. Utilisez pipette multicanaux d'ajouter 100 pi d'EB milieux contenant des cellules dans chaque puits de 96 – rondes microplaques bien. Placer 96 – rondes microplaques bien dans un incubateur. 2. Identification des fenêtres de temps critique de la voie de signalisation clés (s) pour cardiogenèse Ajouter modulateurs spécifiques des voies de signalisation et de contrôle du véhicule dans chaque puits de plaques de microtitration à 96 puits contenant des cellules ES à des moments différents comme le jour 0, jour 1, jour 2, jour 3 et jour 4, Half etc de puits dans chaque 96 bien-plaque (48 puits) sont utilisés pour chaque point de temps de démarrage du traitement. Laver les modulateurs en changeant des médias EB pour chaque 48 puits à différents points de temps d'arrêt. Par exemple, pour obtenir deux jours de traitement pour les cellules ES à partir de 0 jour, laver modulateurs au jour 2. Pour tout traitement de plus de 48 heures, le changement des médias EB complété avec des modulateurs frais tous les deux jours jusqu'à les points souhaités temps d'arrêt. Examiner la contraction EB sous un microscope après jour 7. Score des puits avec traitance EBS positives pour obtenir des pourcentages de contracter EBS pour chaque cours différents temps de traitement. Les points moment critique pour cardiogenèse ES sont les délais dans lesquels contenaient le plus haut pourcentage de contracter EB traitées par les modulateurs de signalisation par rapport à la maîtrise du véhicule. 3. Vérification des fenêtres temporelles de signalisation pour cardiogenèse dans EBS fabriqués à partir de gouttelettes suspendues Préparer des boîtes de Petri en ajoutant avec 3-4 ml de PBS pour empêcher l'évaporation. Suivez les étapes 1,1 ~ 1,5 pour préparer les cellules ES à 2.5×10 4 cellules / ml densité cellulaire finale. Verser le mélange dans un plat de cellules bactériennes pour un accès facile. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 20 gouttes ul (contenant environ 500 cellules) sur les couvercles inversé. Ne pas laisser les gouttelettes individuelles au toucher. En général, un couvercle peut accueillir jusqu'à 80 gouttes. Retournez le couvercle sur le plat contenant du PBS. Incuber pendant 24 heures ou 48 heures pour permettre la formation EB dans un incubateur. Laver EB formé à partir de gouttelettes suspendues de chaque couvercle avec 3 ml de milieu EB et piscine 2 couvercles d'EBS pour un nouveau plat de Pétri. Ajouter le média EB à un volume total de 10ml. Transfert EB en suspension sur 0,2% de gélatine revêtement des plaques 6 puits à 4 jours. En général 30 EBS sont transférés à chaque puits. Ajouter le média EB pour obtenir le volume de 2 ml finale pour chaque bien. Incuber de signalisation modulateurs à la période identifiée à partir de 96 puits expériences assiette. Observez la contraction EB sous microscope après jour 7 et cardiogenèse peut encore être caractérisé par RT-PCR, immunomarquage et d'autres, si nécessaire.