心筋梗塞のマウスモデルにおける冠動脈結紮および心筋内注入

滅菌手術器具（表1）及び3"綿ひっくり返されたアプリケーターは、滅菌underpad上に配置されています。ビーズ滅菌器（Germinator 500）オンになっている。 マウスは（年齢：> 6週間、重量：> 18グラム）は、トリブロムエタノールの20μlの/ gのBW（; – 約40分持続250mg/kg）の腹腔内注射で麻酔する。 マウスはつま先-ピンチに応答しないときは、乾燥や胸部の左側からそれらを保護するために目に適用される滅菌潤滑油が（涙がリニューアル）皮膚から毛を削除するには、脱毛剤（例えばNairさん）でコーティングされています。 脱毛は、実行中の暖かい水とbetadine /アルコールスワブで洗い流される外科領域の消毒に使用されます。 マウスは、プレキシガラスのテーブルに固定されている暖かいdeltaphase等温パッドの上に配置されます。各肢は、テープを使用して固定化されていると太い糸ではその場で上顎を保持するために上部の歯の下に水平に配置されます。 テーブルは、垂直に配置されており、光ファイバ、光は経食道照明のために頸部に直接輝いています。これは、このようにPEチューブの挿入を​​容易に可視化するために気管を可能にする、喉の開口部が明るいオリフィスとして表示されるように正確に配置する必要があります。 速度125回/分;最大吸気圧10月12日CMH 2 O; *注チューブは、一定の陽圧換気（TOPO人工呼吸器を管理するための人工呼吸器（95％O 2 / 5％CO 2に接続）に接続されています：設定値）は、ひずみとジェンダー1-3異なります。換気が同期胸の動きが確認されると、接続が手術中に抜管を防ぐためにテープでパッドに固定されています。 胸から持ち上げ、皮膚を引っ張って歯鉗子を使用すると、第3位メスハンドルに接続された第10滅菌外科用メスの刃は、胸骨に皮膚と平行に1.5センチメートル切開を行うために使用されます。 湾曲したヴァンナのmicroscissorsは胸筋をカットし、肋間筋に小さな穴を作るために使用されます。 ストレート、鈍microscissorsは3リブカットスルーするために使用されます。 9ミリメートル小児眼科の反射鏡は、胸郭を撤回するために使用されます。 湾曲鉗子を使用して、心臓からの心膜を引っ張り、ゆっくりとそれが開いて破れに歯鉗子を使用してください。 Castroviejo針ホルダーは6mmテーパーポイント3月8日針の糸を使用して、冠動脈を（心の長軸に沿って）左前下に8から0ポリエチレン縫合糸は、それに垂直。 時限再灌流のために削除できる一時的な合字の場合は、PE90の滅菌0.5〜1センチメートルピースが冠状動脈と平行に中心に配置されます。第一冠状動脈の下にループされた縫合糸が、、その後、チューブに接続されています。それが解放される時に、合字を緩めている。希望と閉塞/再閉塞の時は4を変更できるようにこれを繰り返すことができます。プロトコルの長さと使用される麻酔の種類に応じて、補充が必要になることがあります。 永続的な閉塞の場合は、冠状動脈の下混入合字は、単に接続されています。白化やジスキネジアは明らかであり、縫合糸の長い方の端を 5〜10カットされます。 心筋内注入（S）の場合は、30ゲージ滅菌斜め針付き滅菌ハミルトンシリンジは、合字の右側の損傷の領​​域の上に心の底に導入される。針は、傷害の領域に進出し、わずかにベベルが約国境地帯で見られることが引き出される。シリンジ内の溶液（2 -3μl）の一部は心臓に注入し、針を所定位置に保持される。注射器は、別の1〜3ミリメートル撤回され、ソリューションの残りの部分は注入されます。ソリューションによって形成される水疱が消散するまでシリンジを所定位置に保持される。針はその後削除されます。いずれかの出血がある場合は出血5-7停止するまで、綿棒を静かに針の挿入部位に押し付けている。 心筋の操作が完了すると、リブのリトラクターが削除され、胸腔は6から0 surgiproの縫合糸を使用して2〜3マットレス縫合で閉じられます。 2〜3マットレス縫合糸は、筋肉に適用され、その後2〜3マットレス縫合をするために行われる、滅菌生理食塩水0.25％marcaine 1:10（0.1ml/25gマウス）の1-3滴を胸の筋肉を閉じるために作られています皮膚を閉じます。 マウスは、人工呼吸器から削除されます。一度リズム、急速な、浅い呼吸が確認され、マウスを抜管することができます。 0.5ミリリットル暖かい滅菌生理食塩水は、背側皮下空間に注入され、それがモビリティ（1時間の最小値を）取り戻すまでのマウスは、ケージ内の温暖化のパッドの上に配置されます。 生存実験のために、マウスをケージに戻し入れられ、屠殺時までビバリウムに戻った。最初の2日間、食べ物は湿らせた摂食を促進するためにケージの床の上に配置（ので、彼らは痛みを引き起こす可能性があるまで到達する必要がない）とブプレノルフィンは6 – 12時間毎に投与する必要があります。術後のケアも十分な可動性、身づくろい、そして食習慣を確認するために最初の週の毎日の監視が含まれます。 手術器具はエタノールで拭いて次の手術の前にビーズ滅菌器に挿入されます。 屠殺時、マウスはペントバルビタールナトリウム（; 55〜65 mg / kgを65mg/ml）で麻酔する。麻酔の適切な面が達成されると、胸腔が開かれます。 心臓はまだ、寒い塩化カリウムを含む23ゲージの注射針と注射器を打っている（のKCl、30mMの）または2,3 – ブタンジオンmonoxime（BDM; 10mMのは）しながら穿刺するために心室の後基底領域を使用してソリューションのです心臓が拡張期で逮捕されるまで徐々にチャンバー内に注入。 心臓が削除されると、PBSを含む注射器は逆行残っているすべての血液を除去するために心を洗浄灌流するために使用されます。急性試験の場合は、再灌流の期間の終了時に、LADは閉塞の原点で再連結される。 1パーセントエバンスブルーを含む溶液は、大動脈に注入されます。心臓が抽出されると、それは、1％2,3,5 -トリフェニルテトラ塩化物中でインキュベート、同じ厚さの3つのセクションに横方向に切断し、形態学的解析11の結像される。慢性毒性試験のために、心臓は、その後ルーチンの手順にしたがって処理して組み込み、固定液に浸漬する。スライドはその後組織学的に染色され、9,10,12（サイオン、NIHイメージJ、またはイメージプロプラスを使用）形態学的解析のために撮像することができます。 代表的な結果： 正しく完了したら、マウス（雄：年齢8〜10週間、22〜28グラム、女性：年齢10〜12週、20〜26グラム）の生存率は以下のとおりです。以上、急性虚血/再灌流と虚血プレコンディショニングの実験では90％以上恒久的な動脈の結紮の研究で85％、および心筋内注射のための約80％。初期の損傷がより容易に目に見える代謝の変化ではなく、構造的なことですので、虚血/再灌流における梗塞サイズの決定と虚血プレコンディショニングの実験がLADで提供されていない心臓を灌流される大動脈に1パーセントエバンスブルー色素を注入することによって実行されます（図1A）。心臓が削除され、横方向に半分に切断されると、組織は梗塞サイズ（図1B）を測定するために2,3,5 – トリフェニルクロリドの1％溶液中でインキュベートされる。領域が同じ倍率で撮像さマイクロメータを使用して較正することができますサイオンやNIHイメージソフトウェアを使用して測定されます。これらの数値は、リスク/左心室と梗塞のリスクが11でサイズ/エリアで面積を計算するために使用されます。違いは体重と心臓の大きさとそのケアの変化をもたらすことができる株は、比較のために心臓重量、体重、または脛骨の長さにこれらの対策を正規化するために注意が必要です。 このような壊死などの総構造変化、減肉、および心室拡張の恒久的な動脈の結紮の結果。左心室への相対的な梗塞サイズおよび壊死に対する治療および/または時間の効果の比較、チャンバ領域、永久閉塞モデル（図2A）の隔壁と左心室自由壁の厚さもサイオンやNIHのイメージングを使用して測定することができます。ソフトウェア。 picrosirius赤色/緑色で速く（図2B）とコラーゲンの染色は、壁の補強8-10の機能的な指標に相関insterstitial線維症を測定するために使用することができます。図3の画像は、恒久的な動脈の結紮は、次の心臓の国境地帯に注入6ulソリューション（エバンスブルー）の分布を表します。それはtransmurallyも基地に向かってだけでなく、けがの方向に進行していることに注意してください。 図1。 A.エヴァンのブルーは前に切除の大動脈に注入する。このイメージは、心臓（ステンドグラス）や閉塞部位（非染色）の潅流領域を示す。B.エヴァンのブルーとTTCは、急性虚血/再灌流傷害に続く染色。これはunoccluded地域だけでなく、代謝的に実行可能な組織のTTC染色（赤）を染色した青色色素の分布を示す代表的な画像（20倍）です。壊死領域が染色されないので、これらは（概説）薄いままです。 図2。 A.ヘマトキシリンおよびエオシン染色。これは、4日後に心筋梗塞で梗塞領域を介して横方向に切断マウスの心臓（20倍）のH＆E染色の代表画像（20倍）である。 *は、組織の壊死を示し、矢印のポイント肉芽組織に、RV =右心室とLV =左心室。B. Picrosirius赤色と緑色で速く染色。これはpicrosirius赤/ポストMI 4週間でのマウスの心臓の断面の高速グリーン染色の代表画像（​​20倍）。細胞質の汚れの緑とコラーゲン線維が赤です。 6ul心筋内注射後図3。エバンスブルー色素染色の分布。これは、すぐに冠動脈結紮（12倍）以下の国境地帯で6ul心筋内注射した後、心臓全体にエバンスブルー色素のグローバルおよび経壁分布を示す代表的な画像です。