מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי
Summary
הטכניקה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הצומת לימפה מפשעתי (LN) הוא התווה. טכניקה כזו מאפשרת בזמן אמת,<em> In vivo</em> מחקר microvasculature הלימפה צומת ומבנה הן במהלך הומאוסטזיס וזיהום. טכניקה זו ניתן להתאים מחקרים סחר סלולריים לאתרים אחרים הצומת לימפה.
Abstract
בלוטות הלימפה (של LN), הנמצא בכל הגוף, הם מרכיב בלתי נפרד של מערכת החיסון. הם משמשים כאתר לזירוז של תגובה חיסונית אדפטיבית, ולכן, את התפתחותם של תאים מפעיל. ככזה, LNs הם המפתח הלחימה פתוגנים הפולשים ושמירה על הבריאות. הבחירה של LN ללמוד מוכתב על ידי נגישות המודל הרצוי; הלימפה מפשעתי ממוקם היטב ובקלות תומך במחקרים של מודלים רלוונטיים ביולוגית של העור וזיהומים הרירית באיבר המין.
LN מפשעתי, כמו LNs כל, יש רשת ענפה כלי הדם המספקים לו את הדם. באופן כללי, זו רשת כלי הדם כוללת את עורקיק להאכיל העיקרי של LN כי לאחר מכן סניפים הזנות venules אנדותל גבוהה (HEVs). HEVs מתמחים עבור קידום הסחר של תאים חיסוניים לתוך LN במהלך הומאוסטזיס והן זיהום. איך HEVs להסדיר סחר לתוך LN תחת שניהם בנסיבות אלה הוא אזור של חיפושים אינטנסיביים. להאכיל LN עורקיק, יש השפעה ישירה על הזרם HEVs והוא האספקה העיקרי של חומרים מזינים בדם עשיר התא לתוך LN. יתר על כן, שינויים עורקיק ההזנה מעורבים בקידום אינדוקציה של תגובה חיסונית אדפטיבית. Microvasculature LN יש חשיבות ברור בשמירה על אספקת הדם האופטימלי LN ועל ויסות זרם לתוך תא החיסון LN, אשר הם מרכיבים חיוניים לתפקוד תקין LN התגובה החיסונית לאחר מכן.
היכולת ללמוד את microvasculature LN in vivo היא המפתח הבהרת איך את המערכת החיסונית ואת microvasculature אינטראקציה ומשפיעים זה על זה בתוך LN. כאן, אנו מציגים שיטה בתחום ההדמיה vivo של הצומת לימפה מפשעתי. אנו מתמקדים הדמיה של microvasculature של LN, תשומת לב מיוחדת שיטות להבטיח את המחקר של כלי בריא, היכולת לשמור על דימות של כלי קיימא במשך מספר שעות, וכימות של גודל כלי הדם. שיטות זלוף של microvasculature עם תרופות vasoactive כמו גם את הפוטנציאל לאתר ולכמת תנועה הסלולר מוצגים גם.
מיקרוסקופיה Intravital של LN מפשעתי מאפשר הערכה ישירה של כלי הדם פונקציונליות בזמן אמת ממשק של ממשק ישיר בין תאים חיסוניים, LN, ואת microcirculation. טכניקה זו פוטנציאל להיות בשילוב עם טכניקות החיסונית רבים וסימון התא ניאון כמו גם מניפולציות כמו ללמוד vasculature של LNs אחרים.
Protocol
Discussion
מיקרוסקופיה Intravital של הצומת לימפה מפשעתי המובא כאן מספק את היכולת microvasculature תמונה של הצומת לימפה ב-vivo. לכן, זה מקל על אמצעי תצפית ישירה בזמן אמת. הדמיה של microvasculature LN הוא אתר ייחודי המאפשר אחד כדי ללמוד את הממשק בין התגובה החיסונית ועל כלי הדם. באמצעות הכנה זו, ניתן להתמקד כוון במיוחד התגובה החיסונית, שינויים בכלי הדם, או על אינטראקציה בין השניים.
כמו עם כל הגישות ניסיוני, מיקרוסקופיה intravital תקן יש גם יתרונות ומגבלות. תקן IVM, כגון הכנת המתואר כאן, יכול בקלות להיות שונה, ואת כבר הוכיח בעבר על ידי המחברים, כדי לאפשר מיקרוסקופיה epifluorescent באמצעות הקדמה של צבעי ניאון נותב או אוכלוסיות תאים הנקרא. למרות IVM רגיל לא נותן את האפשרות של הדמיה תלת מימדי ו התחקות כגון תינתן על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים או אנגיוגרפיה, מעקב תא מושגת עדיין בשני ממדים המאפשר התא אל התא אל התא vasculature אינטראקציה להיות צפו לכמת ובשיתוף עם הממשל ב-vivo ו מכתים הבאים עם נוגדנים ניאון ניתן להשתמש כדי לתת נתונים על ביטוי החלבון / סמן בזמן אמת.
יש לציין, טכניקות חלופיות הדמיה דורשים סביבה סטטית עבור תמונות, לחיצה על אזור הניתוח או תוספת של coverslip על הכנת שטוח יש צורך לעיתים קרובות. זה מגביל, אם לא מבטל, את היכולת פעיל perfuse מתווכים וסקולרית או אחר על הכנת להעריך שלמות כלי הדם ופיזיולוגיה וכו ', או שימוש בטכניקות אחרות, כגון התרחבות ניסויים שנערכו במסגרת הכנת IVM. יתר על כן, תקן IVM אינה דורשת הכנה שטוח לחלוטין, אינו מושפע תנועה, כמו זה שנוצר על ידי הנשימה של החיה. תקן זה מאפשר IVM לשמש באזורים כירורגית יותר עם reproducibility יותר. זה בא לידי ביטוי על ידי הכנה צומת מפשעתי הלימפה המתוארת כאן. בהתחשב בגודל ובצורה של הצומת לימפה, הכנת לא ניתן שטוח מבלי לפצוע את הרקמות ואת המיקום של הצומת מעורר תנועה משמעותית עקב הנשימה של בעלי חיים. סוגיות אלה יהיה קשה להתגבר בשיטות אחרות, אבל הם עסקו בקלות באמצעות הכנה IVM תקן תיאר.
לסיכום, הכנת שפורטו לעיל ניתן לשלב עם כל מספר של אחרים ביוכימיים, כלי הדם, ו / או טכניקות החיסונית כגון העברה של תת קבוצות של מופעל או התאים שכותרתו, אינדוקציה של היפוקסיה, ושוב הביטוי של דלדול של מתווכים וסקולרית. עם זאת, יישומים נוספים תלויים בריאות הכנה הראשונית. לכן, חיוני תמיד לבדוק את בריאותם של vasculature עתה צילמו ומוערכת. נקודות המפתח להשגת הכנה הבריאות הבטחת הכנה היא perfused הזמן בטמפרטורת הגוף עם PSS equilibrated ומזעור מגע ומתח דגש על אזור הניתוח במהלך הניתוח.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות, קרן קנדה עבור חדשנות, באוניברסיטה של קולומביה הבריטית המרכז לחקר דם אוניברסיטת צפון לפנה"ס.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich |
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
