Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Overzicht: Het protocol is opgesplitst in vier delen. Deel 1 beschrijft hoe voor te bereiden de voeding bacteriën. Deel 2 beschrijft hoe de voorbereiding van de worm cultuur. Deel 3 beschrijft hoe om te scoren levensduur. Part 4 toont een aantal representatieve resultaten, en in deel 5 wordt beschreven hoe u de voorbereiding van de gewenste oplossingen. Levensduur experimenten enkele weken in beslag. Voor elke stap van het protocol week, is dag en tijd van de dag opgenomen om de planning te vergemakkelijken. De L4 stadium (dag 0) wordt gebruikt als referentiepunt voor de gehele protocol. 1. De voorbereiding van Feeding bacteriën Dit gedeelte beschrijft de bereiding van de voeding bacteriën. De specifieke E. coli-stam gebruikt om C.elegans feed is genoemd OP50. Voorafgaand aan dit protocol, om kruisbesmetting van de worm cultuur met andere bacteriën te voorkomen, is de OP50 stam is gemaakt carbenicilline / ampicilline resistente 21. Bereid de OP50 vier tot vijf dagen op voorhand. Alle materialen die in contact komen met OP50 moeten steriel zijn. Dag -7: donderdag (week 1): Inoculatie 5 ml TB met 100 ug / ml ampicilline en 0,1 ng / ml amfotericine B met een OP50 kolonie en incubeer overnacht bij 37 ° C in een bacteriële shaker. Dag -6: vrijdag (week 1). 'S ochtends 08:30. Inoculeer vroeg om voldoende tijd voor de cultuur tot verzadiging te bereiken Verdun de nacht cultuur van OP50 1:2000 in 300 ml TB met 50 ug / ml ampicilline. Incubeer de cultuur in een bacteriële shaker voor 8-12 uur bij 37 ° C tot verzadiging is bereikt. Sta niet toe dat de cultuur om te groeien langer dan 14 uur. Breng de OP50 in een steriele, pre-gewogen centrifugebuis. Pellet de OP50 door centrifugatie gedurende 10 min bij 3500 rpm (2200 xg) in een tafelblad centrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de OP50 pellet in steriel water en opnieuw pellet door centrifugeren. Twee keer Herhaal deze te wassen. Na de tweede wasbeurt, verwijder zorgvuldig alle resterende water. Er mag geen water worden gelaten in de buis. Weeg de centrifugebuis met de pellet en aftrekken van het gewicht van de lege centrifugebuis om het gewicht van de pellet te bepalen. Grondig resuspendeer de pellet in S-te voltooien tot een concentratie van 100 mg / ml. Geen klonten dient te worden overgelaten. De concentratie van 100 mg / ml OP50 dienen te corresponderen met 2 x10 10 bacteriën / ml. Gebruik een foto spectrometer om het aantal bacteriën per ml te bepalen of de relatie tussen de optische dichtheid en het aantal bacteriën per ml is bekend. Indien nodig, de concentratie van de OP50 voeden oplossing voor 2 x10 10 bacteriën / ml. Bewaar de OP50solution bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt voor de worm cultuur. 2. De voorbereiding van een synchrone Worm Cultuur Deze paragraaf beschrijft de bereiding van de worm cultuur. Het doel is het genereren van een leeftijd-synchrone bevolking van wormen. Alle materialen die in contact komen met C.elegans na de behandeling bleekmiddel in stap 5 moeten steriel zijn. Platen zijn bewaard bij 20 ° C, tenzij anders aangegeven. Dag -6: vrijdag (week 1), 16u00: Transfer van de dieren om een nieuwe plaat Neem 5-10 dagen oud NGM plaat waarop de meerderheid van de worm bevolking bestaat uit uitgehongerd L1 larven. Steriliseren een metalen spatel door kort te verwarmen boven een bunsenbrander. Laat het afkoelen. Gebruik de afgekoelde spatel te snijden agar stukken van het bord met de uitgehongerde wormen. Overdracht een aantal van deze brokken op een frisse 10 cm NGM plaat bezaaid met OP50. Incubeer ca.. 65 uur bij 20 ° C tot de meerderheid van de worm bevolking bestaat uit zwangere volwassenen. De tijd die het duurt voor de uitgehongerde L1 dieren uit te groeien tot zwangere volwassenen kan variëren van stam tot stam. Dag -3: maandag (week 2) 10:00: Opzetten van een synchrone bevolking Verzamel wormen uit de 10 cm plaat door ze te wassen van de plaat met 5-10 ml steriel water. Breng de worm / water-oplossing in een 15 ml conische buis. Was de wormen door centrifugeren 2 min in een tafelblad centrifuge bij 1200 rpm (280 xg). Gooi supernatant en voeg 10 ml water. Herhalen. Verwijder supernatant en voeg 5 ml vers bereide bleekwater / NaOH-oplossing (2,5 ml bleekmiddel, 1 ml NaOH 10N, 6,5 ml H 2 O). Incubeer gedurende 5 minuten bij RT tot de wormen open te breken. Zorg ervoor dat u voorzichtig vortex elke minuut. De voortgang van de reactie onder de microscoop te ontleden. Zodra alle volwassenen te ontbinden, voeg 5 ml M9 buffer om de reactie te neutraliseren. Was de eieren drie keer met 10 ml M9 buffer door het centrifugeren van 2 min bij 2500 rpm (1100 xg). Was de eieren een keer met 10 ml S-te voltooien door centrifugeren 2 min bij 2500 rpm (1100 xg). Verwijder de bovenstaande vloeistof, voeg 10 ml S-compleet en breng de oplossing om een ​​nieuwe 50 ml conische buis. Voeg 30 ml van de S-te voltooien tot een uiteindelijk volume van 40 ml. Zachtjes schudden 's nachts de buis bij kamertemperatuur op een nutator of soortgelijk apparaat. Dag -2: dinsdag (week 2), 12.00 uur: Zaad van de dieren in platen Onder het ontleden omvang, controleer dan of de wormen uitgekomen tijdens de nacht. Bepaal de concentratie van wormen in de S-complete oplossing door het tellen van het aantal wormen in 10 uL druppels met behulp van een dissectie scope. Tellen minstens 10 druppels voor elk monster. Resuspendeer de wormen bij een concentratie van 80-100 wormen / ml in S-te voltooien. Voeg carbenicilline (stock 100 mg / ml) tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml en amfotericine B (stock 250 ug / ml) tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 ug / ml. Schudden op een nutator. Als voorbereiding grotere hoeveelheden van wormen, gebruik dan een 600 ml nunclon kolf met filter cap. Op 14:30 voeg de OP50 bereid in deel 1 tot een uiteindelijke concentratie van 6 mg / ml (= 1,2 x10 9 bacteriën / ml). Zet de OP50 tot 4 ° C. Overdracht 120 pi van de worm/OP50 oplossing in elk putje van een 96 wells plaat. Gebruik platen met 96 putjes met een transparante bodem. Zorg ervoor dat de wormen in suspensie te houden tijdens het pipetteren. Seal de plaat met behulp van een tape sealer om besmetting en verdamping te voorkomen. Schud de plaat op een microtiterplaat shaker gedurende 2 minuten en incubeer gedurende 2 dagen bij 20 ° C tot de dieren bij de L4 stadium. Dag 0: donderdag (week 2) voor de middag: Steriliseer dieren door het toevoegen van Fluorodeoxyuridine (FUDR) Voor het steriliseren van de dieren toe te voegen 30 ul van een 0,6 mM FUDR stockoplossing aan elk putje. Deze stap brengt de uiteindelijke volume in elk putje tot 150 pi en vermindert de uiteindelijke concentratie van OP50 van 6mg / ml tot 5 mg / ml (1×10 9 bacteriën / ml). Seal de plaat met behulp van tape jagers en schud het 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Als de OP50 werd toegevoegd om 2:30 op dag -2, is het belangrijk dat de FUDR is toegevoegd voor de middag. Keer terug platen om de 20 ° C incubator Dag 1: vrijdag (week 2): Voeg drugs aan cultuur 09:00 door het merendeel van de dieren worden zwangere en bevat een aantal eieren per stuk. Voeg de geneesmiddelen waarvan het effect op levensduur is te testen op de gewenste concentratie. Als het oplossen van de drugs in DMSO de eindconcentraties van DMSO mag niet meer dan 0,6%, zoals DMSO concentraties van meer dan 0,6% verkorten C.elegans levensduur. Na toevoeging van het geneesmiddel, sluit de platen met tape sealer en schud het 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Keer terug platen om de 20 ° C incubator Het toevoegen van de drugs af en toe kan doden een paar dieren per plaat, vooral bij gebruik van een oplosmiddel anders dan water. Gebruik een omgekeerde microscoop om te controleren op dode dieren. Over het algemeen moet er minder dan 10 dode dieren per 96 wells plaat. Keer terug platen om de 20 ° C incubator. Dag 4: maandag (week 3): Change jagers Toe te staan ​​verse zuurstof aan de cultuur gaan de sealer te verwijderen, wacht een minuut en sluit de plaat. Schud de plaat gedurende 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Herhaal dit een keer per week. Dag 5: dinsdag (week 3): Voeg nieuwe OP50 aan uithongering te voorkomen Voeg 5 pi van de 100 mg / ml OP50-oplossing dat was in deel 1 bereid om elk van de 96 putten hongersnood te voorkomen. 3. Scoren van de levensduur. Deze paragraaf beschrijft hoe de overleving van de gesynchroniseerde worm bevolking van deel 2 wordt bewaakt totdat de dieren stierven. Te houden aan de dieren in de platen met 96 putjes, gebruik dan een omgekeerde microscoop met een 2x of 2,5 x doelstelling. Record overleving gegevens drie keer per week, maandag, woensdag en vrijdag. Gebruik beweging om te bepalen of de dieren worden levend of dood. Sterk licht, met name blauw licht, induceert de dieren te verplaatsen. Verwijder geen dode dieren uit de test. Af en toe kan dieren die niet bewoog en werden bepaald dood in de vorige telling gaan later. Op dag 0, tellen aan het begin van het experiment het totale aantal wormen in elk putje. Censor putten die meer dan 18 dieren uit de analyse bevatten als dieren in deze putten niet genoeg OP50 en zal effecten van calorische restrictie. Om de kans dat de dieren te verplaatsen schudden de 96 wells plaat op een microtiterplaat shaker gedurende 2 minuten te verhogen. vóór het tellen. In elke sessie tellen, record datum en het aantal dieren datbewegen als levende dieren. Beweging in een vloeistof is veel gemakkelijker dan op vaste media en kan worden geïnduceerd door sterke lampen. Het gebruik van een hogere vergroting kan helpen om heel subtiele bewegingen zoals die van de top van de keelholte plek. Dergelijke subtiele bewegingen zijn vaak de enige beweging waargenomen in zeer oude dieren. Keer terug platen om de 20 ° C incubator Herhaal stappen 2-4 om de twee tot drie dagen totdat alle dieren zijn dood. 4. Representatieve resultaten. In dit gedeelte wordt een voorbeeld van hoe een verslag van de levensduur gegevens die zijn gegenereerd door deze test en een aantal representatieve resultaten te houden. Figuur 1A toont een voorbeeld van hoe de levensduur gegevens vast te leggen tijdens deze test. Een Excel-sheet wordt gebruikt om bij te houden van het voortbestaan ​​van de populaties in elk putje. Voor elke goed het te coördineren in de plaat, stam, drugs, concentratie van het geneesmiddel en het totale aantal dieren leven op dag 0 (X0) is opgenomen aan het begin van het experiment. Record date, evenals het aantal levende en dode dieren drie keer per week, om het overleven van de verschillende bevolkingsgroepen in elk putje te volgen. De grafiek van de resultaten, het berekenen van de fractie van de dieren levend voor elke dag en plot als een functie van de tijd in dagen. P-waarden moeten worden berekend met behulp van statistische pakketten zoals STATA of vergelijkbare software. Het medium levensduur van C.elegans is afhankelijk van de temperatuur. Figuur 1B laat zien dat afhankelijk van de temperatuur veranderingen in de levensduur nauwkeurig worden gereproduceerd door de microtiterplaat op basis van levensduur test 22. Ook de microtiterplaat test reproduceert veranderingen in de levensduur van de mutanten gemeld levensduur die verschillen van de wild-type N2 dieren 23 tot 24 25 (afb. 1C) hebben. De test kan ook worden gebruikt om meer kwantitatieve uitspraken te doen. In Fig1D betekenen levensduur is uitgezet als een functie van de concentratie Mirtazepine 7. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de gemiddelde levensduur van 7-12 bevolking, die elk in een andere goed. Ook al is het aantal dieren per goed is relatief laag (5-15 dieren) van de well-to-well variatie is relatief klein kan worden afgeleid uit de fout bars. Figuur 1. De microtiterplaat gebaseerd levensduur test reproduceert accuraat veranderingen in de levensduur in de literatuur. (A) Sample verzamelde gegevens in een Excel-spreadsheet. Tijdens elke sessie het tellen van de datum, de coördinatie van de put en het aantal levende en dode dier werd opgenomen. Aan het begin van het experiment, was het totale aantal dieren in elke goed bepaald. (B) Survival curve van wild-type (N2) dieren gegroeid bij 20 ° C en 25 ° C. (C) overlevingscurven van stammen met mutaties die levensduur beïnvloeden. Alle vier de stammen werden getest in parallel op 20 ° C. (D) Dosis-respons curve van Mirtazepine behandelde N2 dieren. De gemiddelde levensduur is uitgezet als een functie van de Mirtazepine concentratie. Foutbalken geven de SEM van 8 wells per conditie. 5. Materialen. M9 buffer, 1000 ml 6 g Na 2 HPO 4 3 g KH 2 PO 4 5 g NaCl 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml Autoclaaf Potassiumphosphate buffer pH 6,0, 1000 ml 136 g KH 2 PO 4 Voeg gedeïoniseerd water tot 900 ml Pas de pH op 6.0 met 5M KOH Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml Autoclaaf Trace metal-oplossing 1,86 g Na 2 EDTA 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O 0,016 g CuSO 4 1000 ml gedeïoniseerd water Autoclaaf en op te slaan in het donker. S-basismedium, 1000 ml 5,9 g NaCl 50 ml 1M kalium fosfaat, pH 6.0 1000 ml gedeïoniseerd water Autoclaaf Laat de oplossing afkoelen en voeg dan 1 ml van 5 mg / ml cholesterol (opgelost in Et-OH). Kaliumcitraat 1M, 1000 ml 268,8 g tripotassium citraat 26,3 citroenzuur monohydraat Voeg 900 ml gedeïoniseerd water Pas de pH op 6.0 met 5M KOH Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml Autoclaaf S-compleet medium, 1000 ml 977 ml S-basale 10 mL 1M kaliumcitraat pH 6 (steriele) 10 ml Trace metalen oplossing (steriel) 3 ml 1M CaCl 2 (steriele) 3 mL 1M MgSO 4 (steriele) NGM agar 3,0 g NaCl 2,5 g pepton(Uit caseïne, alvleesklier verteren) 17g Agar Voeg gedeïoniseerd water tot 975 ml en een roerstaaf Autoclaaf Na het autoclaveren afkoelen tot 55 ° C en voeg de volgende onderdelen: 0,5 ml van 1 M CaCl 2 (steriele) 1 ml van 5 mg / ml Cholesterol in ethanol 1 ml 1M MgSO 4 (steriele) 25 mL Potassiumphosphate buffer, pH 6,0 (steriele) TB, 1000 ml 12g Bacto Trypton 24 g Gist Extract 4 mL glycerol Voeg 900 ml gedeïoniseerd water Autoclaaf Na het autoclaveren afkoelen tot 55 ° C en voeg de volgende component: Voeg 100 ml 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 0,6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml 100 mg FUDR Los op in 670 ml steriele S-complete, maken 10 ml of 45 ml porties. Bewaren bij -20 ° C. 100 mg / ml carbenicilline, 10 ml 1 g carbenicilline 10 ml steriel gedeïoniseerd water Steriel filtraat en aliquot Bewaren bij -20 ° C. Gebruik bij een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml 250ug / ml amfotericine B, 4 ml 1 mg amfotericine B 4 ml Et-OH Bewaren bij -20 ° C Gebruik bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 ug / ml